İki Epitel Hücre Hattında İki Endojen İyon Kanalının Yüksek Verimli Fonksiyonel Çalışması için Membran Potansiyelinin Floresan Bazlı Bir Analizi

1. Hücre kaplama ve farklılaşma EMEM’deki kültür Calu-3 ve Caco-2 hücreleri, bir T-75 şişesinde% 20 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin (kalem / strep) içerir. Hücreler% 80-100 akıcılığa ulaştığında, ortamı T-75 şişesinden aspire edin. Hücreleri bir kez 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile nazikçe yıkayın. Hücre tek katmanına 2 mL önceden ısıtılmış% 0.25 Tripsin /% 0.1 EDTA ekleyin ve hücrelerin kültür şişesi yüzeyinden kalkmasına ve tek hücreli bir süspansiyona ayrışmasına izin vermek için T-75 şişesini yaklaşık 5 dakika boyunca 37 ° C’ye yerleştirin. Hücreler şişe yüzeyinden kaldırıldıktan sonra, toplam 10 mL hücre süspansiyonu için 8 mL kültür ortamı (adım 1.1) ile reaksiyonu nötralize edin.NOT: Hücre kümelerini mekanik olarak 10 mL serolojik pipet ile tek hücreli bir süspansiyona ayırın. Hücreleri 96 delikli bir plakaya (~ 140.000-150.000 hücre / kuyu) veya 384 delikli bir plakaya (~ 45.000-50.000 hücre / kuyu) % 30-40 akıcılıkta plakalayın.Tam bir 96 delikli plakayı plakalamak için, 50 mL’lik bir konik tüpte 18,5 mL kültür ortamına 1,5 mL hücre süspansiyonu ekleyin. Karıştırdıktan sonra, her bir oyuğa 200 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Tam bir 384 delikli plakayı plakalamak için, 50 mL’lik bir konik tüpte 17 mL kültür ortamına 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin. Karıştırdıktan sonra, her bir oyuğa 50 μL hücre süspansiyonu ekleyin.NOT: Hücre kümeleri olmadığından ve tek hücrelerin her bir kuyucuğa eşit olarak dağıtıldığından emin olun. Kaplamadan sonra ortamı her 2 günde bir değiştirin. Hücreler farklı kuyucuklar arasında aynı anda akıcılığa ulaşmazsa, plakayı atın ve adım 1.5’i tekrarlayın. Tohumlandıktan sonra, hücrelerin 3-5 gün içinde% 100 akıcılığa ulaşmasını bekleyin. Fonksiyonel etütlerden 24 saat önce ortamı değiştirin. 2. CFTR fonksiyonel tahlil tampon çözeltisi hazırlama Sodyum içermeyen, klorür içermeyen tampon çözeltisini Tablo 1’de listelenen reaktiflerle hazırlayın. Reaktifleri doku kültürü derecesine, çift damıtılmışH2O’ya (ddH2O) ekleyin. Reaktiflerin oda sıcaklığında gece boyunca karıştırarak (buharlaşmayı önlemek için kapalı bir kapta) çözünmesine izin verin. Çözelti stabil hale geldiğinde, pH’ı ölçün. Çözeltinin pH’ı 7.4’ü aşarsa, pH’ı 7.4’e ayarlamak için damla damla 1 M N-metil-D-glukamin (NMDG) çözeltisi ekleyin.NOT: Çözeltinin pH’ını HCl ile ayarlamayın, çünkü çözelti klorürsüz kalmalıdır. Çözeltinin 30 dakika daha karışmasına izin verin ve çözeltinin ozmolaritesini ölçün.Tampon çözeltisinin ozmolaritesini 300 ± 5 mOsm/kg’lık bir fizyolojik aralığa düşürün. Tampon çözeltisini filtreleyin ve steril şişelerde saklayın.NOT: Çözelti 4 °C’de 6 aya kadar saklanabilir. 6 aydan daha uzun süre saklanırsa, kullanmadan önce oda sıcaklığında pH ve ozmolariteyi kontrol edin. 3. CFTR fonksiyonel tahlil Membran potansiyel boyasını sodyum içermeyen, klorür içermeyen tampon çözeltisinde (0,5 mg boya/1 mL tampon çözeltisi) çözün ve 37 °C’ye ısıtın.NOT: Membran potansiyel boya tozunu ışığa maruz bırakmaktan kaçının. Kültür ortamını Calu-3 veya Caco-2 hücre monokatmanlarından çıkarın ve boya içeren çözeltiyi her bir kuyucuğa ekleyin (96 delikli bir plaka için kuyu başına 195 μL, 384 delikli bir plaka için kuyu başına 95 μL).NOT: 384 delikli plakaların kuyucuğu başına 112 μL’ye kadar eklenebilir. Hücrelerin boyayı 37 ° C’de ve% 5 CO2’de 35 dakika boyunca yüklemesine izin verin. Boya çözeltisi ile yüklenen hücreleri floresan plaka okuyucusuna taşıyın. Uyarma = 530 ± 5 nm, emisyon = 560 ± 5 nm ile plakanın altından floresan ölçümleri alın 30 s aralıklarla 5 dakika boyunca sürekli taban çizgisi okumaları yaparak başlayın. 1 μM forskolin’in (1x) nihai konsantrasyonu için her bir kuyucuğa 5 μL düşük konsantrasyonlu bir forskolin veya DMSO çözeltisi ekleyin. 15 s aralıklarla ölçümlerle 20 dakika boyunca bir stimülasyon okuması yapın.96 delikli plaka formatı için, düşük konsantrasyonlu (40 μM forskolin (1:25 seyreltme)) forskolin çözeltisini, 2 μL 1 mM forskolin (1.000x) stok çözeltisi veya DMSO’yu 48 μL sodyum içermeyen, klorür içermeyen tampon çözeltisi içinde seyrelterek hazırlayın.NOT: Düşük konsantrasyonlu 40 μM forskolin’i, 1 μM forskolin’in son konsantrasyonu için bir sonraki adımda ikinci bir seyreltme (1:40 seyreltme) izler. 384 delikli plaka formatı için, düşük konsantrasyonlu (20 μM forskolin (1:50 seyreltme)) çözeltiyi, 1 μL 1 mM (1.000x) forskolin stok çözeltisi veya DMSO’yu 49 μL sodyum içermeyen, klorür içermeyen tampon çözeltisi içinde seyrelterek hazırlayın.NOT: Düşük konsantrasyonlu 20 μM forskolin’i, 1 μM forskolin’in son konsantrasyonu için bir sonraki adımda ikinci bir seyreltme (1:20 seyreltme) izler. 10 μM CFTRInh172’lik son konsantrasyon için 5 μL düşük konsantrasyonlu CFTRInh172 çözeltisi ekleyin. 30 s aralıklarla ölçümlerle 15 dakika boyunca bir inhibisyon okuması yapın.96 delikli plaka formatı için, CFTRInh172 düşük konsantrasyonlu (400 μM CFTRInh172 (1:25 seyreltme)) çözeltisini, 48 μL sodyum içermeyen, klorür içermeyen tampon çözeltisi içinde 10 mM CFTRInh172 (1.000x) stok çözeltisinin 2 μL’sini seyrelterek hazırlayın.NOT: Düşük konsantrasyonlu 400 μM CFTRInh172’yi, 10 μM CFTRInh172’lik son konsantrasyon için bir sonraki adımda ikinci bir seyreltme (1:40 seyreltme) izler. 384 delikli plaka formatı için, CFTRInh172 düşük konsantrasyonlu (200 μM CFTRInh172 (1:50 seyreltme)) çözeltisini, 49 μL sodyum içermeyen, klorür içermeyen tampon çözeltisi içinde 1 μL 10 mM CFTRInh172 (1.000x) stok çözeltisi içinde seyrelterek hazırlayın.NOT: Düşük konsantrasyonlu 200 μM CFTRInh172’yi, 10 μM CFTRInh172’lik son konsantrasyon için bir sonraki adımda ikinci bir seyreltme (1:20 seyreltme) izler. Her bir kuyunun floresan yoğunluğu ölçümlerini ölçün ve değerleri ayrı ayrı kuyucukları içeren sütun biçiminde bir elektronik tablo olarak dışa aktarın. Forskolin kaynaklı değişiklikleri hesaplamak için, RFU (Bağıl Floresan Birimleri) ölçümlerini 96 veya 384 delikli plakanın her bir kuyucuğundan, taban çizgisi okumasının son floresan yoğunluğu ölçümüne bölün ve bunları çizin.Alternatif olarak, CFTR fonksiyon 12’nin özgüllüğünü daha iyi doğrulamak için CFTRInh172 aracılı inhibisyon yanıtını nicelleştirin, çünkü forskolin ile akut tedavi, SLC26A912 gibi diğer klorür kanallarının aktivitesi yoluyla membran depolarizasyonuna neden olabilir. Forskolin stimülasyonu sırasında başlangıçtan itibaren maksimum floresan yoğunluğu ölçümü olarak tepe tepkilerini ölçün. CFTR yanıtını ölçmek için eğrinin altındaki bu ölçümü veya alanı kullanın. 4. ENaC fonksiyonel tahlil tampon çözeltisi hazırlama Yüksek sodyumlu, klorürsüz tampon çözeltisini Tablo 2’de listelenen reaktiflerle hazırlayın. Çözelti stabil hale geldiğinde, pH’ı ölçün. Çözeltinin pH’ı 7.4’ün altındaysa, pH’ı 7.4’e ayarlamak için damla damla 1 N NaOH çözeltisi ekleyin.NOT: Çözeltinin pH’ını HCl ile ayarlamayın, çünkü çözelti klorürsüz kalmalıdır. Tampon çözeltisinin ozmolaritesini 300 ± 5 mOsm/kg’lık bir fizyolojik aralığa düşürün. Tampon çözeltisini filtreleyin ve 4 ° C’de steril şişelerde 6 aya kadar saklayın.NOT: Depolama 6 aydan uzunsa, kullanmadan önce oda sıcaklığında pH ve ozmolariteyi kontrol edin. 5. ENaC fonksiyonel tahlil Membran potansiyel boyasını yüksek sodyumlu, klorürsüz tampon çözeltisinde (0,5 mg boya/1 mL tampon çözeltisi) çözün ve 37 °C’ye ısıtın.NOT: Membran potansiyel boya tozunu ışığa maruz bırakmaktan kaçının. Kültür ortamını Calu-3 veya Caco-2 hücreli tek katmanlardan çıkarın ve boya içeren çözeltiyi her bir kuyucuğa ekleyin (96 delikli plakalar için kuyucuk başına 195 μL, 384 delikli plakalar için kuyu başına 95 μL).NOT: Boya çözeltisini ışığa maruz bırakmaktan kaçının. Hücrelerin 37 ° C’de 35 dakika ve % 5 CO2’de boya yüklemesine izin verin. Boya çözeltisi ile yüklenen hücreleri floresan plaka okuyucusuna taşıyın. Floresan ölçümlerini plakanın altından okuyun, uyarma = 530 ± 5 nm, emisyon = 560 ± 5 nm. 30 s aralıklarla 5 dakika boyunca sürekli taban çizgisi okumaları yaparak başlayın. ENaC fonksiyonunu inhibe etmek için, 10 μM amiloridin nihai konsantrasyonu için yüksek sodyum, sıfır klorür tampon çözeltisi içinde çözünmüş 5 μL düşük konsantrasyonlu çözelti amilorid veya düşük konsantrasyonlu çözelti DMSO ekleyin.96 delikli plaka formatı için, 48 μL yüksek sodyumlu, klorürsüz tampon çözeltisi içinde 2 μL 10 mM amilorid (1.000x) stok çözeltisini seyrelterek düşük konsantrasyonlu (400 μM amilorid (1:25 seyreltme)) amilorid çözeltisini hazırlayın.NOT: Düşük konsantrasyonlu 400 μM amilorid, 10 μM amiloridin son konsantrasyonu için bir sonraki adımda ikinci bir seyreltme (1:40 seyreltme) ile takip edilir. 384 delikli plaka formatı için, 49 μL yüksek sodyumlu, klorürsüz tampon çözeltisine 1 μL 10 mM amilorid (1.000x) stok çözeltisi ekleyerek düşük konsantrasyonlu (200 μM amilorid (1:50 seyreltme)) amilorid çözeltisini hazırlayın.NOT: Düşük konsantrasyonlu 200 μM amilorid, 10 μM amiloridin son konsantrasyonu için bir sonraki adımda ikinci bir seyreltme (1:20 seyreltme) ile takip edilir. 45 s aralıklarla ölçümlerle 60 dakika boyunca bir inhibisyon okuması yapın. Veri analizi için adım 3.7’yi yineleyin. Amilorid yanıtını, amilorid ilavesinden yaklaşık 15-20 dakika sonra, başlangıçtan plato noktasına kadar yüzde inhibisyon olarak ölçün. ENaC yanıtını ölçmek için bu farkı kullanın.