مقايسة قائمة على التألق لإمكانات الغشاء لدراسة وظيفية عالية الإنتاجية لقناتين أيونيتين داخليتين في خطين خلويين ظهاريين
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة لدراسة بروتينات الغشاء الكهروجيني عن طريق قياس التغيرات في جهد الغشاء. يوفر هذا الفحص منصة للقراءة الوظيفية لقنوات أيونية متعددة يتم التعبير عنها داخليا في خطوط الخلايا الظهارية.
Abstract
الدراسات القائمة على التألق مناسبة لمقايسات قارئ الألواح عالية الإنتاجية للخلايا في الثقافة. وقد تم استخدامها بشكل شائع في حملات اكتشاف الأدوية التي تستهدف بروتينات القناة الأيونية المؤتلفة التي يتم التعبير عنها بشكل مفرط في خلايا مثل خلايا HEK-293. ومع ذلك ، هناك تركيز متزايد على استخدام خطوط الخلايا ذات الصلة بالأنسجة لدراسة آثار تدخلات الجزيئات الصغيرة. يصف البروتوكول التالي تكييف مقايسة جهد الغشاء القائم على التألق لدراسة القنوات الأيونية المعبر عنها داخليا في خطوط الخلايا الظهارية. يفصل فحص إمكانات الغشاء مقايسة عالية الإنتاجية لنشاط قناة الكلوريد لمنظم التوصيل عبر الغشاء للتليف الكيسي (CFTR) في خطي خلايا ظهارية تمت دراستهما بشكل شائع ، Caco-2 و Calu-3. بالإضافة إلى ذلك ، تصف هذه الورقة تطبيقا جديدا لهذا النظام لقياس نشاط قناة الصوديوم الظهارية (ENaC) بتنسيق عالي الإنتاجية في نفس خطوط الخلايا الظهارية. معا ، توفر هذه المقايسات القائمة على التألق منصة قوية ومرنة لدراسة معدلات الجزيئات الصغيرة ، وتستهدف قناتين ظهاريتين في سياق خلوي ذي صلة.
Introduction
كانت فحوصات النشاط عالي الإنتاجية القائمة على التألق لبروتينات القناة المؤتلفة فعالة للغاية في تحديد معدلات الجزيئات الصغيرة التي لديها القدرة على أن تصبح علاجات مستقبلية1،2،3،4. إحدى الطرق الشائعة لفحص مكتبات الجزيئات الصغيرة لمعدلات القناة الأيونية هي من خلال قياس التغيرات في إمكانات الغشاء. عادة ، يتم إجراء هذه الشاشات باستخدام قنوات مؤتلفة يتم التعبير عنها بشكل غير متجانس في خطوط الخلايا مثل خلايا HEK-2935،6،7.
ومع ذلك ، هناك حاجة للتحقق من صحة “الزيارات” في أنواع الخلايا ذات الصلة. نقترح أن تكون الشاشة الثانوية في خطوط الخلايا ذات الصلة التي تعبر داخليا عن قنوات الاهتمام أمرا مرغوبا فيه. ستحدد هذه الشاشة الثانوية تلك المعدلات التي من المرجح أن تكون فعالة في فحوصات التحقق النهائية التي تعتمد على الأنسجة البشرية الأولية التي يصعب الوصول إليها.
هناك أيضا حاجة إلى أنظمة فحص تتمتع بالمرونة للإبلاغ عن نشاط أهداف القنوات الأيونية المتعددة في نفس نوع الأنسجة. على سبيل المثال ، هناك أدبيات منشورة موضوعية تدعم مفهوم أن CFTR و ENaC يتفاعلان وظيفيا8،9،10. على الرغم من أنه من المعروف أن العديد من خطوط الخلايا الظهارية المدروسة جيدا تعبر عن كل من CFTR و ENaC ، حتى الآن ، لم يتم وصف شروط الفحص لدراسة كليهما بطريقة عالية الإنتاجية.
هذا الفحص المحتمل للغشاء القائم على التألق متعدد الاستخدامات ، لأنه يستخدم مسبارا كيميائيا خارجيا لقياس وظيفة CFTR و ENaC ، متجاوزا الحاجة إلى مجسات مشفرة وراثيا11. كدليل على المبدأ ، تمت دراسة خطين من الخلايا الظهارية شائعة الاستخدام كأمثلة لتسليط الضوء على الخطوات الحاسمة اللازمة لقياس نشاط القناة لكل من CFTR و ENaC.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، وصفنا الطرق القائمة على التألق لقياس نشاط CFTR و ENaC في خط خلايا سرطان القولون والمستقيم الظهاري ، Caco-2 ، وخط خلايا سرطان الرئة الظهاري البشري ، Calu-3. يمكن استخدام مقايسات إمكانات الغشاء هذه في خطوط الخلايا الظهارية لتأكيد فعالية مركبات معدل الجزيئات الصغيرة ، التي تم تحديدها مسبقا في أنظمة التعبير غير المتجانسة ، قبل التحقق النهائي في المختبر في الثقافات الظهارية الأولية المشتقة من المريض.
من الضروري التأكد من أن القياسات المذكورة أعلاه تعزى بشكل مناسب إلى قناة الاهتمام. على سبيل المثال ، يجب أن يظهر القياس المنسوب إلى CFTR الاعتماد على تعبير بروتين CFTR والقوة الدافعة الكهروكيميائية للكلوريد ، والتي يتم تعديلها بواسطة فورسكولين والمثبط CFTRInh-172. وبالمثل ، يمكن أن تعزى التغيرات المحتملة في الغشاء الناتجة عن أميلوريد 10 ميكرومتر إلى ENaC ، إذا كانت تعتمد على تعبير بروتين ENaC وقوة دافعة للصوديوم الداخلي. على الرغم من أننا أكدنا هذه الخصائص ل ENaC في خلايا MDCK بعد النقل مع جميع الوحدات الفرعية الثلاث ل ENaC 2 ، إلا أننا لم نؤكد رسميا بعد أن استجابة الأميلوريد المقاسة في خلايا Caco-2 و Calu-3 تمنحها ENaC. هذا مهم بشكل خاص ، حيث يمكن للأميلورايد تعديل وظيفة مبادل الصوديوم والبروتون NHE3 بالإضافة إلى ENaC13. من المتصور أن فرط الاستقطاب الناجم عن الأميلورايد الذي لوحظ في هذا الفحص يمكن أن يعكس جزئيا الآثار غير المباشرة للتحمض داخل الخلايا على القنوات الأخرى. للتأكد من أن فرط الاستقطاب الناجم عن الأميلورايد الذي تم قياسه باستخدام هذه الصبغة الحساسة للجهد الغشائي يتم منحه بواسطة ENaC في خطوط الخلايا المذكورة أعلاه وأنظمة الخلايا الأكثر تعقيدا ، مثل الأنسجة المشتقة من iPSC ، فإننا نؤكد أن هذا النشاط يتم فقده عن طريق ضرب وحدة فرعية ENaC ملزمة (بيتا) في هذه السطور.
يتطلب نجاح هذه المقايسات الانتباه إلى عدة عوامل. أولا ، يجب أن تكون الثقافات الظهارية متقاربة ومتباينة بشكل جيد. لقياس وظيفة CFTR و ENaC ، يجب طلاء ما يقرب من 145000 خلية لكل بئر في 96 لوحة بئر أو 45000 خلية لكل بئر في 384 لوحة بئر. بمجرد وصول الخلايا الظهارية إلى الالتقاء (في غضون 3-4 أيام من الطلاء) ، اترك 2-5 أيام من التمايز. تم تحديد هذا التوقيت سابقا بناء على أقصى تعبير لبروتين CFTR عن طريق النشاف المناعي14. وبالمثل ، تم تحديد التوقيت الأمثل لتعبير ENaC الوظيفي في كلا خطي الخلية ، Calu-3 و Caco-2.
تؤدي الطبقة الأحادية غير المتقاربة أو فرط نمو الخلايا إلى انخفاض قابلية التكاثر عبر النسخ المتماثلة التقنية. في الحالات التي لا تصل فيها الخلايا الموجودة في الآبار الفردية إلى نقطة التقاء في نفس الوقت ، يجب التخلص من هذه اللوحات. بالإضافة إلى ذلك ، قد تكون قراءات خط الأساس غير المستقرة أو نقص استجابات التحفيز مؤشرا على ضعف جودة الخلية ، والتي يجب استبعادها من التحليل. يمكن أن تعكس الاستجابات المنخفضة لمنشط CFTR ، فورسكولين ، أو مثبط ENaC ، أميلورايد ، استخدام الخلايا المارة بشكل مفرط15. على الرغم من أنها ليست مشكلة بالنسبة لخلايا Calu-3 و Caco-2 ، إلا أن الخلايا أو الأنسجة الأخرى قد لا تلتصق جيدا بالألواح وقد تتطلب الطلاء المسبق للآبار. على سبيل المثال ، في الدراسات السابقة ، تم إرفاق ثقافات الخلايا الصفراوية 2D بالألواح باستخدام طلاء الكولاجين16. بدلا من ذلك ، تم زيادة التصاق الأنسجة المعوية ثنائية الأبعاد باستخدام Poly-L-Lysine2.
علاوة على ذلك ، عند اختبار تعديل القنوات الأيونية بواسطة جزيئات صغيرة باستخدام مقايسة قائمة على التألق ، من الأهمية بمكان معالجة القطع الأثرية المحتملة التي تمنحها خصائص الفلورسنت للجزيئات الصغيرة. لتأكيد خصوصية الاستجابات الوظيفية ، يمكن التحقق من صحة فحوصات إمكانات الغشاء باستخدام الطرق الكهربية التقليدية ، مثل دراسات Ussing17.
بعد التأكد من أن الاستجابة المكتشفة بواسطة الأصباغ الحساسة للإمكانات الغشائية يتم منحها على وجه التحديد من خلال قناة الاهتمام ، فإن هذه المقايسات لديها إمكانات هائلة للتحقق من صحة المعدلات الواعدة لقنوات الأيونات الظهارية في سياقها الخلوي ذي الصلة. يمكن لهذه المنصة سد الفجوة بين شاشات المغير عالية الإنتاجية في أنظمة التعبير غير المتجانسة والقياسات الكهربائية الحيوية التي تستغرق وقتا طويلا في الأنسجة الأولية التي يصعب الوصول إليها.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا كريستوفر فلاد ومركز SPARC الحيوي في مستشفى الأطفال المرضى على مساعدتهم في إجراء فحوصات إمكانات الغشاء لقياس CFTR و ENaC. تم دعم هذا العمل من قبل برنامج CFIT بتمويل مقدم من CF Canada ومؤسسة Sick Kids. تم تمويل هذا العمل من قبل حكومة كندا من خلال جينوم كندا ومعهد أونتاريو للجينوم (OGI-148). تم تمويل هذه الدراسة من قبل حكومة أونتاريو. تم دعم S.X. من قبل الجمعية الكندية لأمراض الجهاز الهضمي (CAG) منحة الدكتوراه.
Materials
| Amiloride | Spectrum Chemical | TCI-A2599-5G | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
| CFTRInh-172 | CF Foundation Therapeutics | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C | |
| EMEM, 1xs | Wisent | 320-005-CL | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-450 | |
| FLIPR Membrane Potential Dye | Molecular Devices | R8042 | Stored at 4 °C |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F3917 | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
| Gluconic acid lactone or (D-(+)-Gluconic acid δ-lactone) | Sigma-Aldrich | G4750 | Stored at room temperature |
| HEPES | Bioshop | HEP001.5 | Stored at room temperature |
| Human Bronchial Adenocarcinoma Cell Line (Calu-3) | ATCC | HTB-55 | |
| Human Epithelial Colorectal Adenocarcinoma Cell Line (Caco-2) | ATCC | HTB-37 | |
| N-Methyl-D-glucamine (NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | Stored at room temperature |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-200-EL | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Potassium Gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Stored at room temperature |
| Sodium Gluconate | Sigma-Aldrich | G9005 | Stored at room temperature |
Referencias
- Ahmadi, S., et al. Phenotypic profiling of CFTR modulators in patient-derived respiratory epithelia. NPJ Genomic Medicine. 2, 12 (2017).
- Xia, S., et al. High-throughput functional analysis of CFTR and other apically localized proteins in iPSC-derived human intestinal organoids. Cells. 10 (12), 3419 (2021).
- Jiang, J. X., et al. A new platform for high-throughput therapy testing on iPSC-derived lung progenitor cells from cystic fibrosis patients. Stem Cell Reports. 16 (11), 2825-2837 (2021).
- Hu, J., et al. Human Embryonic Kidney 293 Cells: a vehicle for biopharmaceutical manufacturing, structural biology, and electrophysiology. Cells, Tissues, Organs. 205 (1), 1-8 (2018).
- Hadida, S., et al. Discovery of N-(2,4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl)-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxamide (VX-770, ivacaftor), a potent and orally bioavailable CFTR potentiator. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (23), 9776-9795 (2014).
- Chen, M. X., et al. Validation and optimization of novel high-throughput assays for human epithelial sodium channels. Journal of Biomolecular Screening. 20 (2), 242-253 (2015).
- Maitra, R., Sivashanmugam, P., Warner, K. A rapid membrane potential assay to monitor CFTR function and inhibition. Journal of Biomolecular Screening. 18 (9), 1132-1137 (2013).
- Mall, M. A. ENaC inhibition in cystic fibrosis: potential role in the new era of CFTR modulator therapies. European Respiratory Journal. 56 (6), 2000946 (2020).
- Moore, P. J., Tarran, R. The epithelial sodium channel (ENaC) as a therapeutic target for cystic fibrosis lung disease. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 22 (8), 687-701 (2018).
- Stutts, M. J., et al. CFTR as a cAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269 (5225), 847-850 (1995).
- Merkert, S., et al. High-throughput screening for modulators of CFTR activity based on genetically engineered cystic fibrosis disease-specific iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1389-1403 (2019).
- Bertrand, C. A., et al. The CFTR trafficking mutation F508del inhibits the constitutive activity of SLC26A9. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (6), 912-925 (2017).
- Frelin, C., et al. Amiloride and its analogs as tools to inhibit Na+ transport via the Na+ channel the Na+/H+ antiport and the Na+/Ca2+ exchanger. Biochimie. 70 (9), 1285-1290 (1988).
- Di Paola, M., et al. SLC6A14 is a genetic modifier of cystic fibrosis that regulates Pseudomonas aeruginosa attachment to human bronchial epithelial cells. mBio. 8 (6), 02073 (2017).
- Schiavi, S. C., et al. Biosynthetic and growth abnormalities are associated with high-level expression of CFTR in heterologous cells. American Journal of Physiology. 270, 341-351 (1996).
- Ogawa, M., et al. Generation of functional ciliated cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 12 (1), 6504 (2021).
- Lu, C., Pribanic, S., Debonneville, A., Jiang, C., Rotin, D. The PY motif of ENaC, mutated in Liddle syndrome, regulates channel internalization, sorting and mobilization from subapical pool. Traffic. 8 (9), 1246-1264 (2007).
