La caratterizzazione chimica completa delle biomolecole è fondamentale per comprendere le loro proprietà biologiche e funzionali sottostanti. A tal fine, le scienze “omiche” si sono sviluppate negli ultimi anni, mirando alla caratterizzazione su larga scala di strutture chimiche a concentrazioni biologiche. In proteomica e metabolomica, la SM è diventata uno strumento fondamentale per svelare l’eterogeneità strutturale che si trova nei mezzi biologici, in particolare grazie alla sua sensibilità e capacità di fornire informazioni strutturali attraverso la SM tandem (MS / MS). Nelle strategie MS/MS, uno ione viene selezionato in base alla sua massa, quindi frammentato e, infine, le masse dei suoi frammenti vengono acquisite per stabilire un’impronta digitale della molecola. Gli spettri MS/MS possono, in particolare, essere utilizzati per abbinare database ^spettrali1,2 o ricostruire provvisoriamente le strutture ^madri3,4. Nell’ipotesi che spettri simili appartengano a composti simili, i dati MS/MS possono anche essere utilizzati per costruire reti molecolari (MN) che collegano specie correlate attraverso un punteggio di ^{somiglianza5,6}.

Tuttavia, a causa della proprietà intrinseca della SM di rilevare il rapporto massa-carica (m / z) degli ioni, la tecnica è cieca a una serie di caratteristiche strutturali che rientrano nell’intervallo dell’isomeria (stereo). Ad esempio, i carboidrati sono costituiti da diverse subunità monosaccaridiche, molte delle quali sono stereoisomeri o addirittura epimeri (ad esempio, Glc vs. Gal o Glc vs. Man). Queste subunità sono collegate da legami glicosidici, che possono differire per la posizione del legame (regioisomerismo) e la configurazione sterica del carbonio anomerico (anomerismo). Queste caratteristiche rendono difficile per la SM autonoma distinguere tra isomeri di ^carboidrati7 e solo il regioisomerismo può essere affrontato utilizzando metodi di attivazione ad alta energia8,9,10. Sebbene la derivatizzazione sia un’opzione per interrompere l’equivalenza dei gruppi ^{stereoisomerici11}, richiede un’ampia preparazione del campione. Un’altra opzione più semplice è quella di accoppiare la SM con una dimensione analitica sensibile all’isomeria, come l’IMS.

Poiché questo protocollo è progettato per gli utenti che hanno già familiarità con i concetti di base di IMS e poiché le recensioni dettagliate sono disponibili ^altrove12,13, qui viene fornita solo una breve panoramica dei principi di IMS. IMS è un metodo di separazione in fase gassosa che si basa sull’interazione di ioni con un gas tampone e un campo elettrico, separando infine gli ioni in base alle loro conformazioni in fase gassosa. Diversi principi di IMS accoppiati a MS possono essere trovati su strumenti commerciali: alcuni operano alternando campi elettrici alti e bassi (IMS asimmetrico di campo, FAIMS), mentre la maggior parte opera entro il limite di campo basso, in particolare il tubo di deriva IMS (DTIMS, campo elettrico decrescente lineare), l’onda mobile IMS (TWIMS, onde di potenziale simmetrico) e l’IMS intrappolato (TIMS, alto flusso di ioni di intrappolamento del gas tampone contro i campi elettrici)¹³ . I metodi a basso campo consentono l’accesso a un cosiddetto CCS, una proprietà della coppia ione-gas che rappresenta la superficie (in ^Å2 o ^nm2) dello ione che interagisce con il gas tampone durante la separazione. La CCS è teoricamente indipendente dallo strumento ed è quindi utile per generare dati riproducibili tra diversi ^laboratori14. Le separazioni di mobilità ionica possono essere influenzate da vari parametri e, in particolare, dalle fluttuazioni della pressione del gas e della temperatura del gas nella cella di mobilità. La calibrazione CCS è un modo per rimediare a questo, poiché sia il calibrante che la specie di interesse saranno influenzati in modo ^simile13. Tuttavia, è obbligatorio installare lo strumento in una stanza a temperatura controllata e disporre di un sistema di controllo della pressione del gas affidabile.

Un’evoluzione interessante dell’IMS è IMS/IMS, che è stato introdotto per la prima volta nel 2006 dal gruppo di Clemmer come analogo di MS/^MS15,16. In IMS/IMS, uno ione di interesse è isolato selettivamente in base alla sua mobilità ionica; viene quindi attivato (fino a possibile frammentazione) e viene eseguita una nuova analisi IMS dello ione o dei frammenti attivati. Nel primo progetto strumentale, due celle IMS sono state messe in serie, separate da un imbuto ionico dove si trovava l’attivazione. Da allora, sebbene siano state proposte diverse configurazioni IMS/ IMS (per una revisione, vedi Eldrid e ^{Thalassinos17}), il primo spettrometro di massa commerciale con capacità IMS / IMS è diventato disponibile solo nel 201918. Questo strumento ha sostanzialmente migliorato il concetto iniziale combinandolo con un’altra svolta tecnologica: un design ciclico della cella IMS.

La cella IMS ciclica consente teoricamente di aumentare quasi infinitamente la lunghezza del percorso di deriva e, quindi, il potere risolutivo dello ^strumento19. Ciò è stato ottenuto per mezzo di una particolare geometria dello strumento, in cui la cella ciclica TWIMS è posizionata ortogonalmente all’asse ottico ionico principale. Una regione di matrice multifunzione all’ingresso della cella IMS consente di controllare la direzione del percorso ionico: (i) inviare ioni lateralmente per la separazione IMS, (ii) in avanti per il rilevamento MS o (iii) indietro dalla cella IMS per essere memorizzati in una cella prearray. Da questa cella di conservazione prearray, gli ioni possono essere attivati e i frammenti reiniettati nella cella IMS per la misurazione della mobilità ionica, un approccio che è stato utilizzato con successo per caratterizzare gli stereoisomeri20. In definitiva, i dati raccolti contengono mobilità ionica e informazioni m/z per il precursore e i suoi frammenti.

In una recente pubblicazione che ha utilizzato questo disegno ciclico per le analisi dei glicani (Ollivier et ^al.21), abbiamo dimostrato che il profilo di mobilità dei frammenti contenuti in tali dati IMS / IMS agisce come un’impronta digitale di una biomolecola che può essere utilizzata in una strategia di rete molecolare. La rete risultante, chiamata IM-MN, ha portato all’organizzazione di set di dati glicemici in modo strutturalmente rilevante, mentre la rete costruita esclusivamente da dati MS / MS (MS-MN) ha rivelato poche informazioni. Per completare questa pubblicazione e aiutare gli utenti di Cyclic IMS a implementare questo flusso di lavoro, questo protocollo fornisce una descrizione completa del protocollo utilizzato per raccogliere i dati. Questo protocollo si concentra solo sulla generazione dei dati IMS/IMS che gli utenti possono quindi utilizzare per costruire reti IM-MN (^vedi21) o per qualsiasi altra applicazione di loro scelta. La costruzione di IM-MN non sarà presa in considerazione nel presente documento, poiché i protocolli per il networking molecolare sono già ^{disponibili22}. Vengono evidenziati i punti cruciali che devono essere seguiti per generare acquisizioni IMS/IMS preziose e riproducibili. Prendendo l’esempio di uno degli oligosaccaridi studiati da Ollivier et al. ²¹, i seguenti passaggi sono dettagliati: (i) preparazione del campione, (ii) messa a punto dello strumento IMS ciclico, (iii) peak-picking automatizzato dei dati e (iv) calibrazione CCS.