Verwendung eines zyklischen Ionenmobilitätsspektrometers für Tandemionen-Mobilitätsexperimente
Summary
Die Ionenmobilitätsspektrometrie (IMS) ist eine interessante Ergänzung zur Massenspektrometrie zur Charakterisierung von Biomolekülen, insbesondere weil sie empfindlich auf Isomerie reagiert. Dieses Protokoll beschreibt ein Tandem-IMS-EXPERIMENT (IMS/IMS), das die Isolierung eines Moleküls und die Generierung der Mobilitätsprofile seiner Fragmente ermöglicht.
Abstract
Eine genaue Charakterisierung chemischer Strukturen ist wichtig, um ihre zugrunde liegenden biologischen Mechanismen und funktionellen Eigenschaften zu verstehen. Die Massenspektrometrie (MS) ist ein beliebtes Werkzeug, reicht aber nicht immer aus, um alle strukturellen Merkmale vollständig zu enthüllen. Zum Beispiel, obwohl Kohlenhydrate biologisch relevant sind, wird ihre Charakterisierung durch zahlreiche Ebenen der Isomerie erschwert. Die Ionenmobilitätsspektrometrie (IMS) ist eine interessante Ergänzung, da sie empfindlich auf Ionenkonformationen und damit auf Isomerie reagiert.
Darüber hinaus haben die jüngsten Fortschritte die Technik erheblich verbessert: Die letzte Generation von Cyclic IMS-Instrumenten bietet im Vergleich zu linearen IMS-Instrumenten zusätzliche Fähigkeiten, wie z.B. ein erhöhtes Auflösungsvermögen oder die Möglichkeit, Tandemionenmobilitätsexperimente (IMS/IMS) durchzuführen. Während IMS/IMS wird ein Ion basierend auf seiner Ionenmobilität ausgewählt, fragmentiert und erneut analysiert, um Informationen zur Ionenmobilität über seine Fragmente zu erhalten. Jüngste Arbeiten zeigten, dass die Mobilitätsprofile der in solchen IMS/IMS-Daten enthaltenen Fragmente als Fingerabdruck eines bestimmten Glykans fungieren und in einer molekularen Netzwerkstrategie verwendet werden können, um Glykomik-Datensätze strukturell relevant zu organisieren.
Das Ziel dieses Protokolls ist es daher, zu beschreiben, wie IMS/IMS-Daten generiert werden, von der Probenvorbereitung bis zur endgültigen CCS-Kalibrierung (Collision Cross Section) der Ionenmobilitätsdimension, die reproduzierbare Spektren liefert. Am Beispiel eines repräsentativen Glykans zeigt dieses Protokoll, wie eine IMS/IMS-Kontrollsequenz auf einem zyklischen IMS-Instrument aufgebaut wird, wie diese Kontrollsequenz berücksichtigt werden kann, um die IMS-Ankunftszeit in die Driftzeit (d. h. die effektive Trennungszeit, die auf die Ionen angewendet wird) zu übersetzen und wie die relevanten Mobilitätsinformationen aus den Rohdaten extrahiert werden können. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die kritischen Punkte eines IMS/IMS-Experiments klar zu erklären und so neuen zyklischen IMS-Anwendern zu helfen, einfache und reproduzierbare Akquisitionen durchzuführen.
Introduction
Die vollständige chemische Charakterisierung von Biomolekülen ist der Schlüssel zum Verständnis ihrer zugrunde liegenden biologischen und funktionellen Eigenschaften. Zu diesem Zweck haben sich in den letzten Jahren “Omics”-Wissenschaften entwickelt, die auf die großflächige Charakterisierung chemischer Strukturen in biologischen Konzentrationen abzielen. In der Proteomik und Metabolomik ist MS zu einem Kerninstrument geworden, um die strukturelle Heterogenität in biologischen Medien zu entschlüsseln – insbesondere dank ihrer Empfindlichkeit und Fähigkeit, strukturelle Informationen durch Tandem-MS (MS/MS) bereitzustellen. In MS / MS-Strategien wird ein Ion entsprechend seiner Masse ausgewählt, dann fragmentiert und schließlich werden die Massen seiner Fragmente erfasst, um einen Fingerabdruck des Moleküls zu erstellen. MS/MS-Spektren können insbesondere verwendet werden, um Spektraldatenbanken1,2 abzugleichen oder die übergeordneten Strukturen vorläufig zu rekonstruieren3,4. Unter der Annahme, dass ähnliche Spektren zu ähnlichen Verbindungen gehören, können MS/MS-Daten auch verwendet werden, um molekulare Netzwerke (MNs) aufzubauen, die verwandte Spezies durch einen Ähnlichkeitswert verbinden5,6.
Aufgrund der inhärenten Eigenschaft von MS, das Masse-zu-Ladungs-Verhältnis (m/z) von Ionen zu erkennen, ist die Technik jedoch blind für eine Reihe von strukturellen Merkmalen, die in den Bereich der (Stereo-)Isomerie fallen. Zum Beispiel bestehen Kohlenhydrate aus mehreren Monosaccharid-Untereinheiten, von denen viele Stereoisomere oder sogar Epimere sind (z. B. Glc vs. Gal oder Glc vs. Man). Diese Untereinheiten sind durch glykosidische Bindungen verbunden, die sich durch die Position der Verknüpfung (Regioisomerie) und die sterische Konfiguration des anomeren Kohlenstoffs (Anomere) unterscheiden können. Diese Eigenschaften erschweren es für eigenständige MS, zwischen Kohlenhydratisomeren zu unterscheiden7, und nur die Regioisomerie kann mit hochenergetischen Aktivierungsmethoden behandelt werden8,9,10. Obwohl die Derivatisierung eine Option ist, um die Äquivalenz stereoisomerer Gruppen zu stören11, erfordert sie eine umfangreiche Probenvorbereitung. Eine weitere, einfachere Option besteht darin, MS mit einer analytischen Dimension zu koppeln, die empfindlich auf Isomerie reagiert, wie z. B. IMS.
Da dieses Protokoll für Benutzer gedacht ist, die bereits mit den grundlegenden Konzepten von IMS vertraut sind, und weil detaillierte Überprüfungen an anderer Stelle verfügbar sind12,13, wird hier nur ein kurzer Überblick über die Prinzipien von IMS gegeben. IMS ist ein Gasphasen-Trennverfahren, das auf der Wechselwirkung von Ionen mit einem Puffergas und einem elektrischen Feld beruht und letztendlich Ionen gemäß ihren Gasphasenkonformationen trennt. Verschiedene Prinzipien von IMS, die an MS gekoppelt sind, finden sich auf kommerziellen Instrumenten: Einige arbeiten bei abwechselnd hohen und niedrigen elektrischen Feldern (feldasymmetrisches IMS, FAIMS), während die meisten innerhalb der niedrigen Feldgrenze arbeiten – insbesondere Driftröhren-IMS (DTIMS, linear abnehmendes elektrisches Feld), Wanderwellen-IMS (TWIMS, symmetrische Potentialwellen) und gefangenes IMS (TIMS, hoher Durchfluss von Puffergas-Einfangionen gegen elektrische Felder)13 . Die Low-Field-Verfahren ermöglichen den Zugang zu einem sogenannten CCS, einer Eigenschaft des Ion-Gas-Paares, die die Oberfläche (in Å2 oder nm2) des Ions darstellt, das während der Trennung mit dem Puffergas interagiert. CCS ist theoretisch instrumentenunabhängig und somit nützlich, um Daten zu generieren, die zwischen verschiedenen Labors reproduziert werden können14. Ionenmobilitätstrennungen können durch verschiedene Parameter und insbesondere durch Schwankungen des Gasdrucks und der Gastemperatur in der Mobilitätszelle beeinflusst werden. Die CCS-Kalibrierung ist eine Möglichkeit, hier Abhilfe zu schaffen, da sowohl das Kalibrant als auch die interessierende Spezies in ähnlicher Weise betroffen sein werden13. Es ist jedoch zwingend erforderlich, das Gerät in einem temperaturgeführten Raum zu installieren und über ein zuverlässiges Gasdruckregelsystem zu verfügen.
Eine interessante Weiterentwicklung von IMS ist IMS/IMS, das erstmals 2006 von Clemmers Gruppe als Analogon zu MS/MS15,16 eingeführt wurde. In IMS/IMS wird ein Ion von Interesse selektiv aufgrund seiner Ionenmobilität isoliert; es wird dann aktiviert (bis zur möglichen Fragmentierung), und eine neue IMS-Analyse des aktivierten Ions oder der aktivierten Fragmente wird durchgeführt. Im ersten Instrumententwurf wurden zwei IMS-Zellen in Reihe geschaltet, getrennt durch einen Ionentrichter, in dem die Aktivierung stand. Obwohl seitdem eine Reihe von IMS/IMS-Setups vorgeschlagen wurden (für eine Überprüfung siehe Eldrid und Thalassinos17), wurde das erste kommerzielle Massenspektrometer mit IMS/IMS-Fähigkeit erst 201918 verfügbar. Dieses Instrument verbesserte das ursprüngliche Konzept erheblich, indem es mit einem anderen technologischen Durchbruch kombiniert wurde: einem zyklischen Design der IMS-Zelle.
Die zyklische IMS-Zelle erlaubt es theoretisch, die Driftweglänge und damit das Auflösungsvermögen des Instruments19 nahezu unendlich zu erhöhen. Dies wurde durch eine spezielle Instrumentengeometrie erreicht, bei der die zyklische TWIMS-Zelle orthogonal zur optischen Hauptachse der Ionen platziert wird. Ein Multifunktions-Array-Bereich am Eingang der IMS-Zelle ermöglicht die Steuerung der Richtung des Ionenpfads: (i) Senden von Ionen seitwärts für die IMS-Trennung, (ii) vorwärts für die MS-Detektion oder (iii) rückwärts von der IMS-Zelle, die in einer Prearray-Zelle gespeichert werden soll. Von dieser Prearray-Speicherzelle aus können die Ionen aktiviert und die Fragmente in die IMS-Zelle zur Messung der Ionenmobilität reinjiziert werden, ein Ansatz, der erfolgreich zur Charakterisierung von Stereoisomeren verwendet wurde20. Letztendlich enthalten die gesammelten Daten Ionenmobilität und m/z-Informationen für den Vorläufer und seine Fragmente.
In einer kürzlich erschienenen Publikation, die dieses zyklische Design für Glykananalysen verwendete (Ollivier et al.21), zeigten wir, dass das Mobilitätsprofil der in solchen IMS / IMS-Daten enthaltenen Fragmente als Fingerabdruck eines Biomoleküls fungiert, das in einer molekularen Netzwerkstrategie verwendet werden kann. Das daraus resultierende Netzwerk, IM-MN genannt, führte zur strukturell relevanten Organisation von Glykomik-Datensätzen, während das ausschließlich aus MS/MS-Daten (MS-MN) aufgebaute Netzwerk wenig Informationen preisgab. Um diese Veröffentlichung zu ergänzen und Cyclic IMS-Benutzern bei der Implementierung dieses Workflows zu helfen, enthält dieses Protokoll eine vollständige Beschreibung des Protokolls, das zum Sammeln der Daten verwendet wird. Dieses Protokoll konzentriert sich nur auf die Generierung der IMS/IMS-Daten, die Benutzer dann zum Aufbau von IM-MN-Netzwerken (siehe 21) oder für eine andere Anwendung ihrer Wahl verwenden können. Der Aufbau von IM-MN wird hierin nicht berücksichtigt, da Protokolle für die molekulare Vernetzung bereits verfügbar sind22. Die entscheidenden Punkte, die befolgt werden müssen, um wertvolle und reproduzierbare IMS/IMS-Akquisitionen zu generieren, werden hervorgehoben. Am Beispiel eines der von Ollivier et al. untersuchten Oligosaccharide 21 werden die folgenden Schritte detailliert beschrieben: (i) Probenvorbereitung, (ii) Abstimmung des zyklischen IMS-Instruments, (iii) automatisierte Peak-Picking der Daten und (iv) CCS-Kalibrierung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das zyklische IMS der SELECT-SERIE ist ein leistungsstarkes Werkzeug, mit dem eine definierte Ionenpopulation – einer gegebenen m/z- und Ionenmobilität – ausgewählt werden kann, ohne dass eine chromatographische Trennung im Vorfeld erforderlich ist. Das Instrument bietet die Möglichkeit, eine zweidimensionale Fragmentierungskarte dieser Ionenpopulation zu erzeugen, aus der sowohl MS/MS- als auch IMS/IMS-Spektren extrahiert werden können. Der Benutzer muss jedoch mehrere kritische Punkte beachten, die wä…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.O. dankt der französischen National Research Agency für die Finanzierung seines Ph.D. (Grant ANR-18-CE29-0006).
Materials
| 33-α-L- plus 23-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX/XA2XX) mixture | Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland | O-XAXXMIX | XA2XX + XA3XX mixture |
| 33-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX) | Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland | O-XA3XX | Pure XA3XX standard |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality, colorless, 1,000 tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030120086 | Used to prepare the carbohydrate stock solution and dilution |
| FALCON 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm | Corning Science México S.A. de C.V., Reynosa, Tamaulipas, Mexico | 352070 | Used to prepare the aqueous stock solution of 100 mM LiCl |
| Lithium Chloride (ACS reagent, ≥99 %) | Sigma-Aldrich Inc., Saint Quentin Fallavier, France | 310468 | Used to dope the sample with lithium |
| Major Mix IMS/Tof Calibration Kit | Waters Corp., Wilmslow, UK | 186008113 | Calibration solution for MS and IMS |
| MassLynx 4.2 SCN1016 Release 6 (Waters Embedded Analyser Platform for Cyclic IMS 2.9.1 Release 9) | Waters Corp., Wilmslow, UK | 721022377 | Cyclic IMS vendor software for instrument control and data processing |
| Methanol for HPLC PLUS Gradient grade | Carlo-Erba Reagents, Val de Reuil, France | 412383 | High-purity solvent |
| MS Leucine Enkephaline Kit | Waters Corp., Wilmslow, UK | 700002456 | Reference compound used for tuning of the mass spectrometer |
| SCHOTT DURAN 100 mL borosilicate glass bottle | VWR INTERNATIONAL, Radnor, Pennsylvania, US | 218012458 | Used to prepare the solution of 500 µM LiCl in 50:50 MeOH/Water |
| SELECT SERIES Cyclic IMS | Waters Corp., Wilmslow, UK | 186009432 | Ion mobility-mass spectrometer equipped with a cylic IMS cell |
| Website: http://mzmine.github.io/ | MZmine Development Team | – | Link to download the MZmine software |
| Website: https://github.com/siollivier/IM-MN | INRAE, UR BIA, BIBS Facility, Nantes, France | – | Link to an in-house R script containing a CCS calibration function |
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