植物寄生線虫Ditylenchus dipsaciの培養とスクリーニング

本研究に使用した D. dipsaci 株G-137は、プリンスエドワード郡のフィッシュレイク4品種ニンニクから採取され、カナダ農業・農業食品局から提供された。新鮮な培養を開始する場合は、接種方法15についてPoirierらに相談してください。 1. ディプサシ菌の培養 以前に報告された作業15に従って媒体およびプレートを準備する。 500 mL の栄養寒天 (NA) 培地に 23 g/L の NA ( 材料表を参照) と超純水を加えて準備します。滅菌技術を使用して、25 mL のオートクレーブ処理済み NA 培地を 20 枚の使い捨てペトリ皿 (直径 100 mm x 深さ 15 mm) に注ぎます。寒天を室温(22°C)で固化させ、蓋をして約2時間放置し、後で使用するために取っておきます。 最小有機物を含む3.2 g/LのGA基礎培地、20 g/Lのスクロース、15 g/Lの寒天、および蒸留水を含む500 mLのガンボーグB-5(GA)培地を調製する( 材料表を参照)。滅菌技術を使用して、50mLのオートクレーブ処理されたGA培地を10個の使い捨てペトリ皿(直径100mm×深さ25mm)に注ぎます。寒天を室温(22°C)で固化させ、蓋をして約5時間放置し、スプラウトが移るまで滅菌バッグに室温で直立して保存する。メモ:汚染が発生した場合に備えて、余分なメディアプレートが作られています。 前作15から修正した方法に従って種子殺菌を行う。 オートクレーブ1本、攪拌子付き2Lビーカー、鉗子2個、ガラスシャーレ、及び蒸留水1L。200 mLの95%EtOH溶液および200 mLの15%市販の漂白剤溶液を調製する。 エンドウ豆の種子を使用してください( 材料表を参照)。ラボベンチのブンゼンバーナーの炎の近くにある攪拌棒で滅菌された2 Lビーカーに150個の種子を注ぎます。 ビーカー内の種子に200mLの95%EtOHを加え、攪拌プレート上で5分間激しく攪拌し、次いで廃容器中のEtOHを注ぐ。 ビーカーに漂白剤溶液を注ぎ、種子を完全に浸します。攪拌板上で20分間激しく攪拌し、その後、廃液容器に漂白剤を注ぎます。 ビーカーに蒸留水を注ぎ、種子を浸し、攪拌プレート上で20分間激しく攪拌する。水洗を3回繰り返し、各洗浄後に蒸留水を注ぐ。最終的な水洗浄の後、滅菌した種子をガラスのペトリ皿に注ぐ。 汚染をチェックするには、滅菌した鉗子を使用して、層状洪水フード内の各10 cm NAプレート(ステップ1.1.1で準備)に6つの種子を移します。プレートの円周の周りに種子を配置します(ふっくらした種子が最も効果的です)。プレートを実験室ラッピングフィルムで個々に包み、暗所で26°Cで3日間インキュベートした。注:必要以上に多くの種子を播種すると、汚染されていない種子を選択的に使用することができます。 以下の手順でスプラウト転写を行います。 層流フードで、滅菌した鉗子を使用して、各GAプレート(ステップ1.1.2で調製)に2つの汚染されていない種子をプレートします。実験室のラッピングフィルムでプレートを個別に包み、種子が発芽できるように室温で7〜10日間インキュベートする。 前作15から改変した方法に従ってin vitro飼育を行う。 50 mLの20 g/Lスクロース溶液を調製する。フィルター滅菌スクロース溶液と脇に置いておきます。 層流フード内で、根組織を含む寒天片(〜2cm3)を既存の培養プレートから切り出す。エンドウ豆の苗木を含む新しいGAプレート上に500μLのスクロース溶液をピペットし、スクロースの上に寒天立方体を置く。プレートを実験室ラッピングフィルムで個別に包み、室温(〜22°C)でアルミホイルで裏打ちされた箱で培養物を維持する。 継代培養線虫は、8〜9週間ごとに新鮮なGAプレート上で培養物を維持した。線虫は〜8週間後に抽出する準備ができています。 2. ディプサチ菌の抽出と採取 以下の手順に従って D. dipsaci の抽出を行う。 オートクレーブに50 mLビーカー、80 mm漏斗、150 mL蒸留水、およびコーヒーフィルター。漏斗をビーカーに入れ、滅菌コーヒーフィルターで漏斗を並べます。 層流フード内で、滅菌メスを用いて寒天と根組織を1cm3 に切断する。寒天キューブをコーヒーフィルターで裏打ちされた漏斗に移し、寒天に蒸留水をゆっくりと注ぎ、コーヒーフィルターを湿らせます。 コーヒーフィルターで裏打ちされた漏斗をビーカーから取り外し、コーヒーフィルターで裏打ちされた漏斗を交換したら、水位がフィルターの底に触れるまでビーカーに蒸留水を満たします。 コーヒーフィルターで裏打ちされた漏斗とビーカーをアルミホイルで覆います。マウスがコーヒーフィルターを通って収集ビーカーに移動できるように、ベンチトップに一晩(16時間)放置します。注:線虫培養プレートは、解剖顕微鏡で調べたところ、虫が寒天に這い込んだときに抽出する準備ができています。典型的には、プレートは、その最初の接種後6〜8週間で抽出の準備ができている。 D. dipsaciの収集を行う。注:翌日、 D. dipsaci ワームはビーカーの底に定着します。 コーヒーフィルターで裏打ちされた漏斗を取り出し、上部の40mLの水を収集ビーカーから吸引する。落ち着いたワームを混乱させないようにしてください。10 mL プラスチック血清学的ピペットを使用して、残りの液体を 15 mL 円錐遠心管に集めます。注: このコレクションは、アッセイで直接使用できます。24時間以内に使用しない場合は4°Cで置きます。ワームは4°Cで3日間放置することができ、移動性に目に見える影響はありません。漏斗を取り除くと、収集ビーカー内のワームが乱れる可能性があります。集める前に底に落ち着かせてください。 3. インビトロ 低分子スクリーン アッセイプレートを以下の手順に従って調製する。 オートクレーブ処理した蒸留水を滅菌トラフに注ぎ、多チャンネルピペットを使用して、トラフから40 μLの蒸留水を平底96ウェルプレートの各ウェルに分配します。 ピン留めツールを準備し、化学物質を追加する ラボベンチのブンゼンバーナー炎の近くにピナートレイ( 材料表を参照)を設置します。連続するピナートレイに以下を加える:25mLのピン洗浄液、35mLの50%DMSO(水中)、45mLの蒸留水、55mLの70%EtOH、および65mLの95%EtOH。各トレイの前に吸い取り紙を1枚置きます 洗浄液のピンを噛み締め、溶液中のピンを上下に3回(3倍)動かして、ピン留めツールを清掃します。このプロトコルでは、「3x」と「10x」は、溶液中でピナーをそれぞれ3回または10回動かすことと定義されています。吸い取り紙のピンを拭き取ります。この手順をもう一度繰り返します。 次に、ピン3xを蒸留水ですすぎ、続いてピンを吸い取った。この手順をもう一度繰り返します。 最後に、ピン3xを95%EtOHですすぎ、続いてピンを吸い取ります。もう一度繰り返します。ピナーに火をつけ、エタノールを蒸発させます。 96ウェル化学品ストックプレートから化学品をアッセイプレートに3xピン留めしてアッセイプレートに加え、次いでピン10Xをアッセイプレートに移す。洗浄液の前にある紙に吸い込みます。 プレート間のピン留めツールを以下の順序で洗浄し、その間にブロッティング紙上でブロッティング:50%DMSOで3倍(1回)、蒸留水中で3倍(1回)、75%EtOHで3倍(1回)、95%EtOHで3倍(2回)。ピナーに火をつけ、エタノールを蒸発させます。 すべてのピン留めが完了したら、手順 3.2.2 を繰り返します。注:スクリーニングは、最終濃度60μMで実施した。 ワームの追加 最初に再懸濁し、次に低保持チップを使用して5 μLを観察のためにスライドにピペッティングすることによって、コレクションからの線虫の数を数えます。解剖顕微鏡を用いて5μL中の線虫の数を計数する。 滅菌蒸留水を使用して濃度を2ワーム/μLに調整します。マルチチャンネルピペットおよびトラフを用いて、96ウェルプレートの各ウェルに10μL(〜20匹のワーム)を加える。注:約15,000個の D. dipsaci 線虫は、記載された培養および収集方法を用いて培養プレートあたりに収集されるであろう。ウェルあたり20個のワームが使用されるのは、数が少ないため、モバイルワームと不動ワームの明確な視覚化と説明が容易になるためです。 プレートを実験室のラッピングフィルムで密封し、湿ったペーパータオルで包みます。箱に入れ、200rpmに設定した20°C振とう培養器内の粘着性パッドに貼り付けた。プレートの動きを最小限に抑えるために、湿ったペーパータオルを追加して、プレートが箱の中で安定していることを確認してください。 4. データの収集と分析 5日目のプレートを解剖顕微鏡で観察する。DMSO溶媒対照および薬物処理ウェル中の D. dipsaci の移動数および総数をカウントする。 ワームが比較的不動である場合は、2μLの1 M NaOHを最終濃度40 mMにウェルに追加して、運動19,20を刺激する。注:NaOHを追加した後、ワームは即座に移動し、5分以内に表示する必要があります。モバイルワームの数とワームの総数は、モバイルワームの割合を計算するために使用されます。アッセイの長さは、スクリーンの目的に応じて変化し得る。 モバイルワームの割合を計算します。 D. dipsaci スクリーンでは、再現性よく0%のモバイルワームを産出した井戸は、強いヒットとして分類されます。注:解剖顕微鏡のステージ上でプレートを長時間暴露することは、光源がプレートを加熱し、バイオアッセイに可変的な影響を誘発する可能性があるため、回避される。