גידול והקרנה של הנמטודה הטפילית הצמחית דיטלנכוס דיפסאצ'י

זן D. dipsaci G-137 המשמש לעבודה הנוכחית נאסף מאגם הדגים 4 מגוון שום במחוז הנסיך אדוארד וסופק על ידי חקלאות ומזון חקלאי קנדה. אם מתחילים תרבות חדשה, התייעצו עם Poirier et al. למתודולוגיית חיסון15. 1. התרבות של ד. דיפסאצ’י הכן את המדיה והצלחות בעקבות עבודה שדווחה בעבר15. הכינו 500 מ”ל של מדיית אגר מזין (NA) עם 23 גרם לליטר של NA (ראו טבלת חומרים) ומים אולטרה-פוריים. בטכניקה סטרילית, מוזגים 25 מ”ל של מדיית NA אוטוקלבית לתוך 20 כלי פטרי חד פעמיים (קוטר 100 מ”מ x 15 מ”מ עומק). אפשרו לאגר להתמצק בטמפרטורת החדר (22 מעלות צלזיוס) עם המכסה דולק למשך כ-2 שעות והניחו בצד לשימוש מאוחר יותר. הכינו 500 מ”ל של מדיה מסוג Gamborg B-5 (GA) המכילה 3.2 גרם/ליטר של מדיום בסיסי GA עם חומרים אורגניים מינימליים, 20 גרם/ל’ של סוכרוז, 15 גרם/ל’ של אגר ומים מזוקקים (ראו טבלת חומרים). בטכניקה סטרילית, יוצקים 50 מ”ל של מדיית GA אוטוקלבית ב-10 כלי פטרי חד פעמיים (קוטר 100 מ”מ x 25 מ”מ עומק). אפשרו לאגר להתמצק בטמפרטורת החדר (22 מעלות צלזיוס) כשהמכסה דולק למשך כ-5 שעות ומאחסנים זקוף בטמפרטורת החדר בשקית סטרילית עד להעברת הנבטים.הערה: צלחות מדיה עודפות נעשות במקרה של זיהום מתרחש. בצע עיקור זרעים בשיטה ששונתה מעבודה קודמת15. אוטוקלאב אחת של 2 ליטר עם מוט ערבוב, 2 מלקחיים, צלחת פטרי מזכוכית ו-1 ליטר מים מזוקקים. הכינו 200 מ”ל של תמיסת EtOH של 95% ו-200 מ”ל של תמיסת אקונומיקה מסחרית של 15%. השתמש בזרעי אפונה (ראה טבלת חומרים). יוצקים 150 זרעים לכוס 2 ליטר סטרילית עם מוט ערבוב ליד להבת מבער בונזן על ספסל מעבדה. מוסיפים 200 מ”ל של 95% EtOH לזרעים שבתוך הכוס, מערבבים במרץ על צלחת הערבוב למשך 5 דקות, ואז שופכים את EtOH במיכל פסולת. יוצקים תמיסת אקונומיקה לתוך הכוס כדי לטבול לחלוטין את הזרעים. מערבבים במרץ על צלחת ערבוב במשך 20 דקות ואז שופכים אקונומיקה במיכל פסולת. יוצקים מים מזוקקים לתוך הכוס כדי לטבול זרעים ולערבב במרץ על צלחת ערבוב במשך 20 דקות. יש לחזור על שטיפת המים שלוש פעמים, ולמזוג מים מזוקקים לאחר כל שטיפה. לאחר שטיפת המים הסופית, יוצקים זרעים מעוקרים לתוך צלחת הפטרי הכוס. כדי לבדוק זיהום, העבירו 6 זרעים לכל צלחת NA בגודל 10 ס”מ (שהוכנה בשלב 1.1.1) במכסה המנוע הלמינרי באמצעות מלקחיים מעוקרים. סדרו את הזרעים סביב היקף הצלחת (זרעים שמנמנים עובדים הכי טוב). עטפו את הצלחות בנפרד בסרט עטיפה במעבדה ודגרו בחושך במשך 3 ימים בטמפרטורה של 26 מעלות צלזיוס.הערה: ציפוי יותר זרעים מהנדרש יאפשר שימוש סלקטיבי בזרעים שאינם מזוהמים. בצע את העברת הנבטים לאחר השלב הבא. במכסה זרימה למינרי, השתמש במלקחיים מעוקרים כדי לצלוח 2 זרעים לא מזוהמים על כל צלחת GA (הוכן בשלב 1.1.2). עוטפים את הצלחות בנפרד בסרט עטיפה במעבדה ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 7-10 ימים כדי לאפשר לזרעים לנבוט. בצע גידול במבחנה בשיטה ששונתה מעבודה קודמת15. הכינו 50 מ”ל של תמיסת סוכרוז 20 גרם/ל’. המסנן מעקר את תמיסת הסוכרוז ומניח בצד. במכסה גלימה למינרי, חותכים חתיכת אגר המכילה רקמת שורש (כ-2 ס”מ3) מלוח תרבית קיים. פיפטה 500 μL של תמיסת סוכרוז על צלחת GA חדשה עם שתילי אפונה ומניחים קוביית אגר על גבי סוכרוז. עוטפים את הצלחות בנפרד בסרט עטיפה במעבדה ושומרים על התרבית בקופסה מרופדת בנייר אלומיניום בטמפרטורת החדר (~22 מעלות צלזיוס). נמטודות תת-תרבותיות על צלחות GA טריות כל 8-9 שבועות כדי לשמור על התרבות. נמטודות מוכנות לחילוץ לאחר כ-8 שבועות. 2. מיצוי ואיסוף של ד. דיפסאצ’י בצע את החילוץ של D. dipsaci לאחר השלבים הבאים. Autoclave 50 מל, משפך 80 ממ, 150 מל מים מזוקקים, ומסנני קפה. מכניסים את המשפך לכוס ומרפדים את המשפך במסנן קפה סטרילי. במכסה זרימה למינרי, חותכים את האגר ואת רקמת השורש ל-1 ס”מ3 באמצעות אזמל סטרילי. מעבירים את קוביות האגר לתוך המשפך המרופד במסנן הקפה ושופכים באיטיות מים מזוקקים על האגר כדי להרטיב את מסנן הקפה. מוציאים את המשפך המרופד במסנן הקפה מהכוס וממלאים את הכוס במים מזוקקים עד שמפלס המים פשוט נוגע בתחתית המסנן ברגע שמחליפים את המשפך המרופד במסנן הקפה. מכסים את המשפך והכוס מרופדים במסנן קפה בנייר אלומיניום. השאירו את הלילה (16 שעות) על הספסל כדי לאפשר לתולעים לעבור דרך מסנן הקפה לתוך האיסוף.הערה: צלחת תרבית נמטודה מוכנה למיצוי כאשר תולעים זחלו לתוך האגר כאשר נבדקו באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה. בדרך כלל, צלחת מוכנה למיצוי 6-8 שבועות לאחר החיסון הראשוני שלה. בצע את האוסף של D. dipsaci.הערה: למחרת, תולעי D. dipsaci ישקעו לתחתית הכוס. הסר את משפך הקפה המרופד במסנן הקפה ושאף את 40 מ”ל המים העליונים מכוס האיסוף; להבטיח לא לשבש את התולעים המיושבות. באמצעות פיפטה סרולוגית מפלסטיק 10 מ”ל, אספו את הנוזל הנותר לתוך צינור צנטריפוגה חרוטית בגודל 15 מ”ל.הערה: ניתן להשתמש באוסף זה ישירות במבחנים. יש להניח בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס אם לא ייעשה בהם שימוש תוך 24 שעות. ניתן להשאיר את התולעים למשך 3 ימים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ללא השפעה נראית לעין על הניידות. הסרת המשפך עלולה להפריע לתולעים בכוס הקולקציה. תנו להם להתיישב בתחתית לפני האיסוף. 3. מסך מולקולה קטנה במבחנה הכן את לוחות הבדיקה בהתאם לשלבים הבאים. יוצקים מים מזוקקים אוטוקלאבים לתוך שוקת סטרילית, ובאמצעות פיפטה רב-ערוצית, מפזרים 40 μL של מים מזוקקים מהשוקת לכל באר של צלחת שטוחה בעלת תחתית שטוחה של 96 בארות. הכינו כלי הצמדה והוסיפו את הכימיקלים הציבו מגשי פינר (ראו טבלת חומרים) ליד להבת מבער בונזן על ספסל מעבדה. הוסיפו את הדברים הבאים למגשי הפינרים הבאים: 25 מ”ל של תמיסת ניקוי פינים, 35 מ”ל של 50% DMSO (במים), 45 מ”ל של מים מזוקקים, 55 מ”ל של 70% EtOH ו-65 מ”ל של 95% EtOH. הניחו פיסת נייר מכתימה אחת לפני כל מגש נקו את כלי ההצמדה על ידי הוספת הפינים בתמיסת הניקוי והזזת הפינים למעלה ולמטה שלוש פעמים (3x) בתמיסה. בפרוטוקול זה, ‘3x’ ו- ’10x’ מוגדרים כהזזת הפינר למעלה ולמטה בתמיסה שלוש או עשר פעמים, בהתאמה. כתם את הסיכות על נייר הכתם. חזור על הליך זה פעם נוספת. לאחר מכן, יש לשטוף את הפינים פי 3 במים מזוקקים, ולאחר מכן להכתים את הפינים. חזור על ההליך פעם נוספת. לבסוף, יש לשטוף את הפינים פי 3 ב-95% EtOH, ולאחר מכן לטשטש את הפינים. חזור על הפעולה פעם נוספת. להצית את הפינר ולאפשר לאתנול להתאדות. הוסיפו כימיקלים מלוחות המלאי הכימיים בני 96 הבארות כדי לבדוק לוחות על ידי הצמדת 3x לתוך הלוח הכימי, ולאחר מכן העברת הפינים 10X לתוך לוחית הבדיקה. כתם על נייר מול תמיסת הניקוי. נקה את כלי ההצמדה בין הצלחות על ידי שטיפה בסדר הבא, כתם בין לבין על נייר כתם: 3x ב-50% DMSO (פעם אחת), 3x במים מזוקקים (פעם אחת), 3x ב-75% EtOH (פעם אחת), 3x ב-95% EtOH (פעמיים). להצית את הפינר ולאפשר לאתנול להתאדות. חזור על שלב 3.2.2 כאשר כל ההצמדה הושלמה.הערה: ההקרנה בוצעה בריכוז סופי של 60 מיקרומטר. תוספת של תולעים ספרו את מספר הנמטודות מהאוסף על ידי החייאה תחילה ולאחר מכן טפטוף של 5 μL באמצעות קצוות שמירה נמוכים על שקופית לצורך תצפית. ספרו את מספר הנמטודות ב-5 μL באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה. התאימו את הריכוז ל-2 תולעים/μL באמצעות מים מזוקקים סטריליים. באמצעות פיפטה רב-ערוצית ושוקת, הוסיפו 10 μL (כ-20 תולעים) לכל באר של לוחות 96 הבאר.הערה: כ-15,000 נמטודות D. dipsaci ייאספו לכל צלחת תרבית בשיטת התרבות והאיסוף המתוארת. עשרים תולעים משמשות לכל באר מכיוון שהמספר הקטן מקל על הדמיה ברורה וחשבונאות של ניידים וחסרי תנועה. אטמו את הצלחות בסרט עטיפה במעבדה ועטפו במגבת נייר לחה. מניחים בקופסה ומדביקים על כרית דביקה באינקובטור רועד ב-20 מעלות צלזיוס שנקבע ב-200 סל”ד. יש לוודא שהצלחות מתייצבות בקופסה על ידי הוספת מגבת נייר לחה במיוחד כדי להבטיח תנועה מינימלית של הצלחות. 4. איסוף וניתוח נתונים שימו לב ללוחות ביום 5 תחת מיקרוסקופ מנתח. ספרו את מספר המכשירים הניידים ואת המספר הכולל של D. dipsaci בבקרות ממסים של DMSO ובבארות שטופלו בתרופות. אם התולעים חסרות תנועה יחסית, הוסיפו 2 μL של 1 M NaOH לריכוז סופי של 40 mM לבאר כדי לעורר תנועה19,20.הערה: לאחר הוספת NaOH, תולעים יזוזו באופן מיידי ויש לצפות בהן תוך 5 דקות. מספר התולעים הניידות והמספר הכולל של התולעים ישמשו לחישוב שיעור התולעים הניידות. אורך הבדיקה עשוי להשתנות בהתאם למטרת המסך. חשב את שיעור התולעים הניידות. במסכי D. dipsaci , בארות שהניבו באופן משוחזר 0% תולעים ניידות מסווגות כלהיטים חזקים.הערה: חשיפה ממושכת של לוחות בשלב של מיקרוסקופי דיסקציה נמנעת מכיוון שמקור האור יכול לחמם את הלוחות ולגרום להשפעות משתנות על הביו-בדיקה.