모기 및 초파리에 대한 살충제 독성을 정량화하기위한 국소 응용 생물 검정

참고 : 살충제는 인간, 동물 및 환경 적 위험을 유발할 수 있습니다25. 주의, 교육 및 개인 보호 장비를 적극 권장합니다. 사용 된 모든 살충제 및 용제에 대한 재료 안전 데이터 시트를 따르십시오. 1. 후방 표본 후면 3-5 일 된 성인 모기.참고 : 아래의 프로토콜은 유엔 지침 26의 식량 농업기구 (Food and Agriculture Organization of United Nations guidelines26)를 면밀히 준수하는 Aedes aegypti 양육 조건을 반영합니다. 27 ± 1 ° C 및 75 ± 5 % 상대 습도에서 12:12 시간의 밝고 어두운 사이클링으로 모든 생명 단계의 후방 모기. 모기 알을 탈이온수에 담그고 효모26을 첨가하여 부화하거나 침수 된 알을 진공 챔버 내부에 30 분 동안 넣으십시오.참고 : 두 방법 모두 물 내의 산소 함량을 감소시키고 부화27을 증가시킵니다. 새로 부화 한 유충에게 쟁반 내에서 물고기 음식 (또는 지상 고양이 키블과 같은 동등한 식단)을 먹이고 애벌레 밀도가 발달12 (예 : 총 1.5 L의 물을 포함하는 트레이 당 200-250 마리의 유충)에 영향을 미치기 때문에 트레이 사이에서 가능한 한 유사하게 유충 밀도를 유지하십시오. 번데기 단계 (약 7-10 일)에 도달 할 때까지 격일로 애벌레에게 먹이를주고 필요에 따라 음식의 양을 늘리십시오.참고 : 너무 적게 먹으면 애벌레의 성장이 방해 받고 애벌레가 서로 먹을 수 있습니다. 너무 많이 먹으면 애벌레가 죽어서 물이 파울로 변할 수 있습니다. 번데기가 발달하면 매일 성인 모기 케이지의 물 그릇으로 옮기고 10 % 자당 용액 광고 리비툼을 제공하십시오. 성인 출현 첫날을 기록하십시오. 출현이 시작된 지 2 일 후에 새장에서 남아있는 번데기를 제거하십시오.참고 : 수컷 모기는 더 빨리 나타납니다. 남성과 여성이 별도로 출현하는 것을 주목하고 각 테스트에 충분한 남성과 여성을 사용할 수 있는지 확인하십시오. 번데기를 제거한 후 3 일 동안 기다렸다가 테스트를 위해 3-5 일 된 모기를 얻으십시오. 후방 초파리(취리히 대학28의 프로토콜을 느슨하게 따름). 리어 초파리는 23 ± 1 °C 및 60 ± 5 % 상대 습도에서 12:12 h 밝고 어두운 사이클링으로 스톡 병에 균주를 함유합니다.참고 : 초파리 스톡 병에는 75mL의 표준 플라이 배지가 포함되어야하며, 먼저 병 바닥에 액체로 부은 다음 밤새 응고되도록합니다. 인구 과잉과 곰팡이 성장을 방지하기 위해 두 주마다 신선한 음식으로 새로운 재고 병에 식민지를 옮깁니다. 이렇게하려면 휴대용 이산화탄소 (CO2) 디스펜서를 사용하여 파리를 쓰러 뜨리고 마취 된 파리를 얼음 팩 또는 냉장 테이블의 계량 용지로 옮기고 미세 팁 페인트 브러시를 사용하여 파리를 신선한 스톡 병에 브러시로 닦으십시오. 파리가 음식에 떨어지고 익사하는 것을 방지하기 위해이 과정에서 병을 옆구리에 보관하십시오. 2. 중량 측정 접근법을 사용하여 살충제 제형을 준비하십시오. 흄 후드 내부에 0.1mg 정확도의 분석 스케일을 사용하여 중량 측정 접근법에 따라 첫 번째 원액을 만드십시오.참고 : 중량 측정 접근법은 살충제와 첨가 된 용매의 양을 측정하기 위해 질량을 사용합니다. 표준 관행 (용적 접근법)은 첫 번째 원액이 준비 될 때 첨가 된 (고체) 살충제의 양을 측정하기 위해 분석 척도가 필요합니다. 그러나, 첨가된 용매의 양 및 다음의 모든 희석은 부피에 의해서만 측정된다. 중량 측정 접근법은 더 높은 수준의 정확도를 가지며 따라서 선호된다. 첫 번째 원액에 대한 목표 살충제 농도 및 목표 부피 (냉동실에 보관할 때 유출을 방지하기 위해 15 mL 원뿔형 튜브를 사용하는 경우 최대 10 mL 권장)를 결정하고 Eq (1)를 사용하여 첨가 할 살충제 활성 성분 (AI)의 양을 계산하십시오.   (1) 저장 튜브 (더 큰 부피에 권장되는 15 mL 원뿔형 튜브, 1 mL 이하의 부피에 권장되는 1.5 mL 마이크로 원심분리 스크류 캡 튜브)를 준비하고 살충제 및 용매 이름, 목표 농도 및 준비 날짜가 표시된 라벨을 준비하십시오. 튜브와 뚜껑을 랙 또는 홀더 내의 저울에 놓고 저울을 깎아냅니다. 단계 2.1.1에서 결정된 원하는 양의 고체 또는 액체 살충제 AI를 계량합니다. (예를 들어, 대표적인 데이터에 사용되는 델타메트린) 튜브 내로 질량을 기록한다. 스케일을 꿰매고 원하는 부피의 용매 (목표 부피와 동일)를 튜브에 넣고 즉시 뚜껑을 닫고 질량을 기록하십시오. 증발을 피하기 위해 용매 (여기에 사용 된 아세톤)를 첨가 한 직후에 튜브의 뚜껑을 닫고 용액을 혼합하십시오. 실내 온도를 기록하십시오. 아세톤과 같은 일부 용매는 온도에 따라 부피 (및 결과적으로 밀도)에 상당한 변화를 가질 수 있습니다. 즉시 보관하는 경우 튜브 뚜껑을 파라필름으로 감싸고(증발을 줄이기 위해), 튜브 랙/홀더에 넣고(똑바로 세우고 누출을 방지하기 위해), 호일로 덮고(UV 노출을 방지하기 위해), 재밀봉 가능한 비닐 봉지에 넣고(증발을 줄이기 위해), 가방을 -20°C 냉동고에 넣습니다. 즉시 보관하지 않으면 뚜껑이 고정되어 있는지 확인하고 호일 또는 빛으로 보호 된 용기에 덮으십시오. 추가 된 살충제 AI의 질량을 첨가 된 용매의 양 (및 액체 형태의 경우 첨가 된 살충제의 부피)으로 나눔으로써 원액의 실제 농도 (mg / mL)를 계산하십시오. 첨가 된 용매 (또는 액체 살충제)의 부피를 계산하려면 첨가 된 질량을 기록 된 온도에 적합한 알려진 밀도로 나눕니다. 첨가 된 총 질량 (살충제 및 용매)을 첨가 된 총 부피 (액체 형태의 경우 용매 및 살충제)로 나눔으로써 원액의 밀도 (g / mL)를 계산하십시오. 액체 질량을 부피로 변환하기 위한 단계 2.1.7을 참조한다. 10% 희석을 통해 초기 원액을 연속적으로 희석합니다. 필요한 경우 이러한 연속 희석을 사용하여 초기 용량-반응 곡선을 만들어 생물 분석을위한 살충제 농도의 목표 범위를 확인하십시오. 각 튜브에 첨가할 살충제 원액 및 용매의 부피를 계산한다 (예를 들어, 이전 농도의 10%의 10 mL 희석을 위해 9 mL의 용매에 희석된 1 mL의 살충제 원액). 10 초 동안 원액을 소용돌이 치십시오. 스케일에 미리 표지된 첫 번째 희석 튜브를 겉으로 겹쳐씁니다. 피펫을 사용하여 첫 번째 희석 튜브에 필요한 부피의 원액을 추가하십시오. 즉시 두 튜브의 뚜껑을 닫고 첫 번째 희석 튜브에 질량을 기록하십시오. 첫 번째 희석 튜브를 다시 꿰매고 필요한 부피의 용매를 첨가하십시오. 뚜껑을 즉시 닫고, 첨가된 용매의 질량을 기록하고, 첫 번째 희석액을 10초 동안 와류시킨다. 나머지 희석액에 대해 2.2.2 단계와 2.2.3 단계를 반복하십시오. 단계 2.1.6에서 위에서 설명한 바와 같이 모든 희석액을 저장하십시오. 단계 2.1.7에 따라 희석액의 실제 농도를 계산하십시오. 첨가된 총 질량(살충제 용액 및 용매)을 첨가된 총 부피(살충제 용액 및 용매)로 나눔으로써 각 살충제 희석액의 밀도를 계산한다. 각 연속 희석에 대해 이전 살충제 재고 희석액의 밀도를 사용하여 Eq (2)에 따라 새로운 희석액의 밀도를 계산하십시오. (2) 선택 사항 : 연속 희석에 의해 더 작은 증분으로 살충제 희석액을 만듭니다. 초기 연속 희석, 이전 시험 또는 출판 된 문헌의 용량 – 반응 곡선을 사용하여 만들 각각의 새로운 용액의 농도와 부피를 선택하십시오.참고: 선택한 농도는 0-100%의 사망률 범위를 가져와야 하며, Probit 분석을 허용하려면 이 범위에서 최소 세 가지 농도가 있어야 합니다. 연속 희석액을 스톡 용액으로 사용하여 각각의 새로운 희석을 만들고 단계 2.2를 수행하여 10배 희석물 사이에 새로운 희석을 생성합니다. 선택 사항 : 살충제 용액을 Aliquot. 더 많은 양의 살충제 용액이 만들어지면 용액을 1.5 mL 스크류 캡 튜브에 분취하여 잦은 취급 및 빛에 노출되어 스톡 용액의 오염, 증발 및 분해를 방지하십시오. 가장 낮은 농도에서 시작하여 용액을 분취하여 잠재적 인 오염을 줄이기 위해 최고 농도로 작업합니다. 개봉 전에 10초 동안 볼텍싱하여 각각의 원액을 혼합하고, 원하는 부피(예를 들어, 0.5 mL)를 미리 라벨링된 스크류 캡 튜브 내로 피펫팅한다. 분취량을 -20°C 냉동고의 내광성 용기에 보관한다.참고 : 정기적으로 (매월) 분취량을 재고 살충제 희석액에서 직접 채취 한 작은 새로운 분취량으로 교체하는 것이 좋습니다. 이것은 샘플이 벤치에서 사용되는 동안 증발 또는 UV 분해로 인한 오염 또는 다른 실험으로 이월되거나 변화될 가능성을 제한할 것이다. 이 프로토콜은 살충제 용액이 제대로 보관되고 (단계 2.1.6 참조) -20 °C 냉동고에 보관되는 한 여기에서 일시 중지되고 몇 년 후에도 다시 시작될 수 있습니다. 용매 증발을 모니터링하기 위해 보관하기 전에 영구 마커 펜을 사용하여 반월 연골을 표시하십시오. 분취량을 만들기 위해 살충제 용액을 제거 할 때 용액이 제거 될 때마다 반월 연골을 표시하십시오. 3. 국소 적용 생물 분석 작업 공간 준비 참고 : 모기 나 파리를 탈출하기 쉽도록 벤치 탑 곤충 처리 텐트에서 작업하는 것이 좋습니다. 곤충 취급 텐트의 이미지에 대해서는 보충 그림 S1 을 참조하십시오. 냉동실에서 필요한 살충제 용액을 제거하고 즉시 와류시킨 다음 실온에서 내광성 용기에 넣어 살충제를 사용하기 전에 실온으로 따뜻하게하십시오.참고 : 살충제 AI는 더 시원한 온도에서 용매와 분리 될 수 있습니다. 또한, 아세톤 부피는 온도에 따라 변하여 적용된 살충제 복용량을 변경할 수 있습니다. 용액을 혼합하고 실온으로 따뜻하게하면 살충제 용액을 사용할 때 일관성을 보장하는 데 도움이됩니다. 재료 표에서 참조된대로 곤충 취급 텐트에서 국소 적용 분석에 필요한 모든 도구와 재료를 제시하십시오. 아세톤 분취량 당 5 회 세척을 완료하여 분석 등급 아세톤으로 주사기 배럴과 바늘을 청소하십시오. 총 25 회 세척을 위해 5 개의 개별 분취량으로 완료하십시오. 주사기 및 리피터 피펫터 부품에 대한 보충 그림 S2 를 참조하십시오. 각각 0.5 mL의 아세톤으로 5 개의 마이크로 원심분리 튜브를 준비하십시오. 주사기 배럴을 첫 번째 튜브에서 0.025 mL의 아세톤으로 채운 다음 플런저를 신속하게 밀어 아세톤을 폐기물 용기로 배출하십시오. 네 번 더 반복하여 동일한 아세톤 분취액으로부터 총 다섯 개의 아세톤 세척을 완료한다. 그런 다음 주사기 배럴을 공기로 완전히 채우고 공기와 잠재적 인 아세톤 잔해를 폐기물 용기로 배출하십시오. 두 번 더 반복하여 공기로 세 번의 “세척”을 완료하십시오. 아세톤의 나머지 4 개의 튜브에 대해 3.3.2 단계를 반복하십시오. 주사기 플런저와 바늘 상단 사이의 배럴 내에 플런저를 배럴 (~ 5mm)에 약간 당겨 공기 주머니를 만듭니다.참고 :이 공기 주머니는 플런저가 살충제 용액과 접촉하지 않도록 보호하고 살충제 운반을 줄입니다. 국소 적용에 사용할 준비가 될 때까지 주사기를 따로 두십시오. 적용 할 복용량을 포함하는 키를 만들고 난수 또는 문자 생성기 다음에 임의의 ID를 할당하십시오 ( 보충 파일 1 참조). 블라인드 사망률 평가를 위해 플라스틱 보관 컵에 임의의 ID로 라벨을 붙입니다.참고: 필요한 경우 프로토콜은 여기에서 일시 중지하고 나중에 다시 시작할 수 있습니다. 일시 중지하는 동안 몇 시간 이상이 경과하면 주사기가 깨끗한지 확인하고 곤충을 투여하기 전에 약 1 시간까지 살충제 용액을 냉동실에 다시 넣은 다음 3.1 단계를 반복하기 위해 3.3 단계를 반복하는 것이 좋습니다. 4. 국소 생물 분석을위한 표본을 준비하십시오. 절차 개요 는 그림 1 을 참조하십시오. 모기를 분류하고 무게를 측정하십시오. 흡입으로부터의 흡입에 의해 구동되는 흡인기기를 사용하여, 손상된 개인을 설명하기 위해 과잉을 포함하여 분석에 필요한 3-5 일 된 성인 모기의 원하는 수를 흡인하십시오. 모기를 원뿔형 튜브 (튜브 당 최대 100 마리의 모기)로 옮기고 팁을 감싸고있는 면화로 튜브에 넣고 부드럽게 내뿜고 흡인물을 두드리십시오. 흡입기 팁을 제거할 때 면을 사용하여 튜브를 꽂은 다음 뚜껑을 뚜껑으로 꽂습니다. 한 번에 너무 많은 모기로 흡입기와 튜브를 채우지 마십시오.이 모기는 모기에 추가 스트레스를 가중시키고 사망을 초래할 수 있습니다. 튜브의 모기를 4 °C에서 최소 10 분 동안 두거나 얼음 쟁반에 얼음 아래에 묻어 간단히 쓰러 뜨립니다.참고 : 모기는 최소 사망률29로 몇 시간 동안 2 °C에서 유지 될 수 있습니다. 그러나 잠재적 인 부정적인 영향을 줄이기 위해 모기가 얼음 위에있는 기간을 최소화하는 것이 가장 좋습니다. 쓰러진 모기를 곤충 취급 텐트로 옮기고 조심스럽게 모기를 얼음 위에 놓인 플라스틱 트레이 (예 : 페트리 접시)에 넣으십시오. 한 번에 약 50 마리의 모기 만 부어 각 모기가 그 아래의 시원한 쟁반에 닿고 쓰러진 상태를 유지하십시오. 포셉으로 다리 (또는 날개)로 부드럽게 모기를 집어 들고 각 성별을 별도의 홀딩 컵에 넣어 성별로 모기를 분류하십시오. 분류하는 동안 각 성별의 모기 수를 계산하고 원하는 수에 도달하면 중지하십시오. 분류하는 동안, 부상당한 모기 (예를 들어, 다리가 누락 됨) 또는 매우 큰 모기 (예를 들어, 비정상적으로 확대 된 복부) 또는 작은 모기 (육안으로 쉽게 구별 할 수 있음)를 제거하십시오 그 집단의 평균 모기 크기보다 작음).참고 : 부속기에 의한 모기 취급은 부드러운 일차 신체 (예 : 복부)의 구조적 손상을 줄입니다. 모기의 각 컵의 무게를 0.1mg의 정밀도로 분석 척도를 사용하여 기록하십시오. 페트리 접시가있는 빈 컵을 저울에 뚜껑으로 놓고 저울을 깎으십시오. 모기를 용기에 붓고 뚜껑을 위에 놓고 용기를 저울에 놓습니다. 점수 시트에 표본의 합산 무게와 수를 기록하십시오 ( 보충 파일 2 참조). 즉시 표본 컵을 얼음 위에 다시 올려 놓고 고정시킵니다. 시편의 모든 컵을 칭량할 때까지 4.1.5.1-4.1.5.2단계를 반복합니다. 준비된 모기를 무작위 ID로 표시된 얼음 위에 놓인 별도의 컵에 20-25 개의 그룹으로 나눕니다. 모기를 옮길 때 집게로 인한 스트레스와 신체적 손상을 줄이는 것을 목표로합니다. 이상적으로는 포셉을 사용하여 모기를 1-2 번만 선택하십시오 : 분류 / 계량을 위해 한 번, 실험 컵으로 옮길 수있는 잠재적 인 두 번째 시간.참고 : 컵 당 모기의 이상적인 수는 20-25이며, 이는 복제하기에 충분하며 사망률을 평가하는 것이 합리적이며 컵에서 밀도로 인한 스트레스 / 사망을 초래해서는 안됩니다. 초파리를 분류하고 무게를 측정하십시오. 7 초 동안CO2 를 사용하여 파리를 마취하십시오.참고: 파리가 7초 이상CO2 에 노출되면30초를 깨울 때 크롤링과 비행에 어려움을 겪을 수 있습니다. 파리를 벤치 종이로 싸인 얼음 팩에 붓고 미세한 페인트 브러시를 사용하여 남성과 여성을 분리하고 계산하십시오. 페인트 브러시를 사용하여 선택한 파리를 부드럽게 집어 들고 깨끗하고 빈 재고 병에 넣으십시오. 동일한 수의 수컷과 암컷 초파리(예: 수컷 15마리와 암컷 15마리)를 선택하고 스톡 병에 균주 이름과 초파리 합계(예: Canton-S, 30마리의 파리)라고 표시하십시오.참고 : 수컷 초파리는 암컷31의 존재에서 제거 된 후 서로에 대한 공격성이 높아질 수 있기 때문에 암컷과 수컷 초파리를 동등하게 갖는 것이 중요합니다. 따라서 살충제가 아닌 사망률이나 부상을 피하려면 남성과 여성의 수를 동일하게 유지하는 것이 가장 좋습니다 (또는 수컷 초파리를 완전히 생략하십시오). 분석 척도를 사용하여 초파리의 각 병의 무게를 기록하십시오. 페트리 접시를 뚜껑으로 씌운 빈 바이알(임의의 ID로 라벨이 붙어 있고, 3.4단계 참조)을 저울에 뚜껑으로 놓고 저울을 깎아냅니다.참고 : 유리 병은 정적을 크게 줄이기 때문에 초파리와 함께 사용하는 것이 좋습니다. 7초 동안CO2 를 사용하여 바이알의 랜덤 ID에 해당하는 초파리의 병을 마취시킨다. 초파리를 계량 용지에 붓고 종이를 깔때기로 사용하여 파리를 바이알에 도입하십시오. 페트리 접시 뚜껑을 초파리의 바이알 위에 놓고 저울에 놓습니다. 점수 시트에 표본의 무게와 수를 합친 다음 즉시 초파리의 바이알을 얼음 쟁반에 놓고 뚜껑을 맨 위에 올려 파리가 빠져 나가는 것을 방지하십시오. 초파리의 각 병에 대해 4.2.4.1-4.2.4.4 단계를 반복하십시오. 위의 단계가 완료되면 즉시 다음 섹션으로 이동하십시오. 5. 복용량 표본 적절한 살충제 농도로 주사기를로드하십시오. 최소 농축 용량으로 시작하여 각 유기체 그룹과 함께 가장 집중된 복용량으로 작업하십시오. 폐기물을 방지하려면 주사기에 필요한 양의 살충제와 권장 된 추가 2 μL 만 적재하십시오. 얼음 위의 트레이 위에 놓인 계량 용지에 시편을 팁으로 씌우십시오. 깨끗하고 살충제가없는 페인트 브러시 또는 면봉을 사용하여 서로 가까운 표본을 분리하여 투약을 위해 각 표본에 쉽게 접근 할 수 있도록하십시오. 모기의 경우 페인트 브러시를 사용하여 각 표본이 도섬에 누워 있고 복부 표면이 위를 향하고 있는지 확인하십시오. 주사기를 사용하여 살충제 용액 (또는 대조군을위한 아세톤) 한 방울을 모기의 복부 흉부 및 복부 부위와 초파리의 도섬에 바르십시오. 초파리와 같은 작은 크기의 곤충에는 0.2 μL 액적 (10 μL 주사기가 필요함)을 바르고 모기에는 0.5 μL 액적 (25 μL 주사기가 필요함)을 바르십시오.참고 : 살충제 민감성은 부속기 (예 : 날개, 다리 또는 코)와 비교하여 주요 신체 부위 (예 : 머리, 흉부 및 복부)간에 크게 다르지 않습니다.32. 따라서, 적용 부위는 투여량 액적이 일차체에 적용되는 한 정확할 필요는 없다. 복부 흉부와 복부 영역은 종종 쓰러 질 때 등쪽에 누워 있기 때문에 모기로 선택되는 반면, 도섬은 종종 쓰러 질 때 복부 쪽에 누워 있기 때문에 초파리로 선택됩니다. 이렇게 응용 프로그램 사이트의 특이성이 감소하면 이 메서드의 처리량을 늘리는 데 도움이 됩니다. 즉시 표본을 라벨이 붙은 플라스틱 컵에 다시 붓고 그물망과 고무 밴드로 컵을 덮으십시오. 컵을 홀딩 트레이에 넣고 컵에 이 과정에서 죽거나 손상되거나 탈출한 표본을 기록해 둡니다(컵에 있는 표본의 최종 개수에서 제외하기 위해). 첫 번째 컵의 경우, 투약이 완료된 시간을 기록하십시오. 복용량 사이의 살충제 오염을 피하기 위해 시편이 놓인 계량 용지를 교체하십시오. 모든 표본이 적절한 살충제 농도로 투여 될 때까지 각 컵에 대해 투약을 반복하고 모든 표본이 투여 된 종료 시간을 기록하십시오. 젖은 면봉을 통해 각 컵에 10 % 자당 용액을 제공하고 다음날 사망률이 평가 될 때까지 컵을 따로 두십시오. 모기를 27 ± 1 °C에서 75 ± 5 % 상대 습도 5로 저장하고 초파리는 23 ± 1 °C에서 60 ±5 % 상대 습도로 보관하십시오.참고: 코튼 볼을 압착하는 동안 과포화나 불포화를 피하기 위해 주의하십시오. 면봉은 촉촉해야하지만 물방울이 떨어지지 않아야합니다. 컵에 설탕 물을 떨어 뜨리면 표본의 사망률이 발생할 수 있으므로 살충제의 사망률 평가에 영향을 줄 수 있습니다. 6. 사망률 평가 살충제 노출 시작 후 24 시간에 표본 사망률을 기록하십시오. 모기가 날고 똑바로 설 수 있다면 살아있는 것으로 분류하십시오. WHO 6에 설명 된대로 움직이지 않거나 운동 실조증 (비행기를 위해 서거나 이륙 할 수 없음)인 경우 사망 한 것으로간주됩니다. 초파리 8,33에 대해 동일한 사망률 평가를 따르십시오.참고 : 지연된 사망률을 평가하기 위해 사망률은 매일 설탕 물 변화로 48 및 72 시간 후에 추가로 평가할 수 있습니다. 사망률이 기록된 후, 모든 표본 컵을 적어도 1시간 동안 냉동실에 담긴 봉지에 넣어 폐기 또는 후속 사용(예: 분자 또는 화학적 분석)하기 전에 모든 표본이 죽었는지 확인합니다. 7. 반복실험 수행 새로운 표본 세트에 대해 3-6 단계를 반복하고, 살충제 감수성이34 일의 시간에 따라 변할 수 있으므로 매일 동시에 복제를 수행하도록주의하십시오. 표본의 50%를 죽이는 치사량의 정확한 추정을 위해 각 농도에 대해 최소 3번의 반복실험(LD50)을 보장하십시오. 높은 수준의 변동성이 관찰되는 경우 더 많은 반복실험을 포함하십시오. 모든 데이터가 수집된 후 분석을 완료합니다. 8. 결과 분석 스프레드시트 프로그램에 데이터를 기록하고 임의 ID 키를 사용하여 데이터의 마스크를 해제합니다(3.4단계 참조). 통계 프로그램 R( 35)(보충 파일 4의 예제 R 코드 참조) 또는 선택(36 )의 다른 소프트웨어에서 분석하기 위해 데이터를 텍스트 파일( 보충 파일 3의 예제 데이터 참조)로 저장합니다. 소프트웨어 프로그램 내에서 다음 분석을 완료하십시오. 예제 R 코드는 보충 파일 4 를 참조하십시오. 아래의 Eq (3)에 따라 표본 질량 (mg) 당 살충제 (ng)의 복용량을 계산하십시오. (3) 사망률을 계산하고 Abbott의 공식37 을 적용하여 각 대조군37에서 관찰 된 사망률과 관련된 사망률을 수정하십시오. 또는 Schneider-Orelli (1947) 공식을 사용하여 사망률을 교정하십시오38. 어느 한 공식으로, 제어 데이터가 비정상적으로 높지 않는 한, 앞서 설명된 바와 같이, 각 대조군(37 )에서 사망률에 관계없이 모든 데이터에 보정을 적용하고(39) 구현하였다(아래 논의 참조).참고: Abbott의 공식과 슈나이더-오렐리 공식과 같은 동등한 대안은 대조군에서 관찰되지 않은 사망률의 정도에 비례하여 사망률 값을 조정하고 사망률이 100%인 컵의 사망률을 감소시키지 않습니다. 자세한 내용은 이러한 수식에 대해 인용된 참조를 참조하십시오. 보정된 사망률 데이터를 확률 단위(probability unit) 값40 으로 변환하고 살충제 용량과 변환된 사망률 데이터 사이의 선형 회귀를 수행합니다. 카이-제곱 검정을 사용하여 선형 모델의 적합도를 평가합니다.참고: 프로빗 변환을 완료하기 전에 0(사망률 0%) 또는 1(사망률 100%)의 사망률 값이 데이터에서 제거됩니다. 이것은 프로빗 변환의 특성 때문에 필요합니다. 따라서 그래프로 표시된 데이터에는 양성 또는 음성 대조군 또는 0% 또는 100% 사망률을 초래한 기타 데이터(Abbott의 교정이 적용된 후)가 포함되지 않습니다. 이전에 발표된 방법 39,41,42에 따라 시편 균주, 집단 및/또는 성별당 LD50 및95% 신뢰 구간(CI)을 계산합니다. 참고: 두 균주의 95% CI가 겹치지 않는 경우, 균주는 상당히 다른 용량 반응을 갖는다. 적용 가능한 경우, 관심 균주의 LD50을 기준/제어 균주의LD50으로 나눔으로써 저항비(RR)를 계산한다. 그림 1: 국소 적용 분석 프로토콜 다이어그램. 국소 적용 분석 프로토콜은 (A) 얼음 위에서 표본을 분류하고, (B) 분석 척도로 표본을 칭량하고, (C) 살충제 용액으로 표본을 투약하고, (D) 10 % 수크로오스 용액 Ad libitum (담근 면봉을 통해)에 접근 할 수있는 살충제 노출 후 24 시간의 대기 기간 동안 사망률 평가로 시작합니다. 빨간색 화살표는 모기 (왼쪽)와 초파리 (오른쪽)의 대상 살충제 적용 위치를 나타냅니다. 이미지의 크기를 조정하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.