Измерение потребления кислорода в острых полосатостных срезах взрослых мышей

Митохондриальная дисфункция была вовлечена в несколько неврологических заболеваний, включая болезнь Паркинсона (БП), болезнь Хантингтона и болезнь Альцгеймера ^1,2,3. Модели PD, такие как нокаутные мыши PINK1 (KO) и крысы, демонстрируют нарушение митохондриальной функции 4,5,6,7,8,9,10,11. Митохондрии, выделенные из полосатого тела (STR) или всего мозга стареющей мыши PINK1 KO, демонстрируют дефекты в комплексе I 7,10,12,13. Непосредственное измерение скорости потребления кислорода (OCR) является одним из наиболее распространенных методов оценки митохондриальной функции, поскольку OCR связан с продукцией АТФ, основной функцией митохондрий¹⁴. Таким образом, измерение OCR в моделях заболеваний или образцах / тканях, полученных от пациента, может помочь исследовать, как митохондриальная дисфункция приводит к заболеванию.

В настоящее время существует несколько способов измерения митохондриального OCR, включая электрод Кларка и другие электроды O₂, флуоресцентный краситель O₂ и внеклеточный анализатор потока 15,16,17,18,19. В качестве преимущества методы на основе электродов O₂ позволяют легко добавлять различные подложки. Однако их недостаточно для одновременного измерения нескольких образцов. По сравнению с традиционными методами на основе электродов_O2, внеклеточный анализатор потока, широко используемый инструмент для OCR в клеточных культурах или очищенных митохондриях, предлагает улучшенную пропускную способность 15,18,20. Тем не менее, все эти методы обычно применяются для измерения OCR в изолированных митохондриях или клеточных культурах 6,16,17,19,20,21. Выделение митохондрий вызывает непреднамеренное повреждение, а извлеченные митохондрии или клеточные культуры менее физиологически значимы, чем интактные срезы мозга²². Даже когда микроэлектроды используются в срезах, они менее чувствительны и более сложны в эксплуатации, чем в культивируемых клетках²³.

Для решения этих задач мы разработали метод с использованием анализатора внеклеточного потока XF24, который позволяет анализировать множественные метаболические параметры острых полосатых срезов мозга мышей²⁴. Этот метод обеспечивает непрерывную прямую количественную оценку митохондриального дыхания через OCR. Короче говоря, небольшие участки стриатальных срезов мозга помещаются в лунки островковой пластинки, а анализатор использует биосенсоры на основе кислорода и протонов на основе флуоресценций для измерения скорости OCR и внеклеточного подкисления соответственно 17,21,25.

Одной из уникальных особенностей анализатора являются четыре нагнетательные скважины, которые позволяют непрерывно измерять OCR при последовательной закачке до четырех соединений или реагентов; это позволяет измерять несколько параметров клеточного дыхания, таких как базальный митохондриальный OCR, ATP-связанный OCR и максимальный митохондриальный OCR. Соединения, введенные в ходе измерений по протоколу, показанному здесь, представляли собой рабочие концентрации пирувата 10 мМ в первой скважине раствора (порт А), 20 мкМ олигомицина во второй скважине раствора (порт В), 10 мкМ карбонилцианида 4-(трифторметокси) фенилгидразона (FCCP) в третьей скважине (порт С) и 20 мкМ антимицина А в четвертой скважине (порт D), на основе Фрида и ^др.25. Следует отметить, что эти концентрации были рабочими концентрациями, и исходные растворы 10x, 11x, 12x и 13x вводились в порты раствора A-D соответственно. Цель использования каждого решения заключалась в следующем: 1) Пируват был необходим, поскольку без него добавление FCCP имело бы сниженную реакцию OCR, вызванную ограничением доступных субстратов; 2) Олигомицин ингибирует АТФ-синтазу и позволяет измерять АТФ-связанное дыхание; 3) FCCP отделяет окисление от фосфорилирования и позволяет измерять максимальную митохондриальную емкость; 4) Антимицин А ингибирует комплекс III в цепи переноса электронов и, следовательно, позволяет измерять OCR, не связанный с митохондриями.

Концентрацию используемого олигомицина определяли исходя из следующих причин: 1) Рекомендуемая доза олигомицина для большинства типов клеток (изолированных митохондрий или клеточных культур) составляет 1,5 мкМ. По опыту, обычно для экспериментов с срезом используется доза диссоциированных клеток 3х-10х, так как может быть градиент, а проникновение раствора в срезы требует времени. Поэтому концентрация должна быть в диапазоне от 5 мкМ до 25 мкМ. 2) Концентрация 20 мкМ была выбрана на основе Fried et ^al.25. Более высокие концентрации не были опробованы из-за неспецифической токсичности олигомицина. 3) В отчете Underwood et ^al.26 авторы провели эксперимент по титрованию олигомицина и обнаружили, что дозы в 6,25, 12,5, 25 и 50 мкг / мл приводили к аналогичному ингибированию. Более высокая концентрация олигомицина (50 мкг/мл) не ингибировала больше, но имела большую дисперсию. 4) По нашим наблюдениям, определяющим фактором, по-видимому, является проникающая способность олигомицина. Олигомицину трудно проникнуть в ткани, и именно поэтому требуется не менее 7 – 8 циклов, чтобы достичь плато, максимального ответа. До тех пор, пока он достигает плато, торможение считается максимальным.

Ключевой технической проблемой адаптации внеклеточного анализатора флюса для измерения OCR в стриатальных срезах является предотвращение гипоксии тканей. Поскольку буфер не насыщался кислородом в течение всей продолжительности измерений (около 4 ч), гипоксия была центральной проблемой. Это особенно верно для более толстых образцов тканей, где кислород не может диффундировать по всем образцам. Чтобы преодолеть эту проблему, срезы были разделены на толщину 150 мкм, чтобы окружающий кислород мог проникать в середину срезов мозга. Кроме того, 4 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) добавляли в буфер предварительно оксигенированной искусственной спинномозговой жидкости (ACSF), что облегчало определение максимального OCR, как предлагалось ранее²³. Мы исследовали, живы ли клетки. Во-первых, Hoechst 33258 (10 мкМ) и йодид пропидия (10 мкМ) были использованы для изучения того, являются ли клетки здоровыми в этих условиях. Затем мы изучили, являются ли средние колючие нейроны функционально здоровыми, используя запись зажимов. Мы также оценили, были ли терминалы дофамина (DA) в стриатальных срезах функционально здоровыми, измеряя высвобождение DA с помощью вольтамметрии быстрого сканирования. Результаты показали, что стриатальные срезы, которые не были насыщены кислородом (группа ACSF / BSA), были такими же здоровыми, как и контрольная группа²⁴ с кислородом.

Затем мы протестировали различные комбинации толщины среза и размера перфоратора, чтобы определить оптимальные условия стриатального среза для анализа дыхания флюсом. Для анализа OCR с использованием анализатора использовались дорсальные стриатальные срезы различной толщины (150 мкм и 200 мкм) и размеров перфоратора (1,0 мм, 1,5 мм и 2,0 мм в диаметре). Стриатальные срезы толщиной 150 мкм с диаметром перфоратора 1,5 мм имели наивысшую эффективность соединения и OCR в оптимальном для анализатора²⁴ диапазоне.