인슐린 생성 세포로 분화를 위한 쥐 지방조직 중간엽 줄기세포의 분리
Summary
지방 조직 유래 중간엽 줄기 세포 (Ad-MSCs)는 인슐린 생산 세포 (IPCs)로 분화되는 MSCs의 잠재적 인 원천이 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 래트 부고환 Ad-MSCs의 분리 및 특성화를위한 상세한 단계를 제공하고, 동일한 래트 Ad-MSCs로부터의 IPC의 생성을위한 간단하고 짧은 프로토콜을 제공한다.
Abstract
중간엽 줄기 세포 (MSCs)-특히 지방 조직 (Ad-MSCs)에서 분리 된 것들 -은 윤리적 인 우려를 제기하지 않는 재생 가능하고 풍부한 줄기 세포 공급원으로 특별한 주목을 받았습니다. 그러나 Ad-MSC를 분리하는 현재의 방법은 표준화되지 않았으며 특수 장비가 필요한 복잡한 프로토콜을 사용합니다. 우리는 간단하고 재현 가능한 방법을 사용하여 Sprague-Dawley 쥐의 부고환 지방으로부터 Ad-MSC를 분리했습니다. 분리된 Ad-MSCs는 부착성 세포가 섬유아세포 형태를 나타내기 때문에 보통 분리 후 3일 이내에 나타난다. 이러한 세포는 격리 후 1 주 이내에 80 %의 합류율에 도달합니다. 그 후, 계대 3-5 (P3-5)에서, CD90, CD73 및 CD105와 같은 특징적인 MSC 클러스터의 분화 표면 마커에 대한 면역표현형에 의해 단리된 Ad-MSCs에 대한 완전한 특성화를 수행하였고, 이들 세포의 분화를 유도할 뿐만 아니라 골형성, 지방형성, 및 연골형성 혈통을 아래로 유도하였다. 이것은 차례로 단리된 세포의 다분화능을 의미한다. 또한, 우리는 고글루코스 둘베코의 변형된 이글 배지 (HG-DMEM), β-메르캅토에탄올, 니코틴아미드 및 엑센딘-4를 통합함으로써 간단하고 비교적 짧은 프로토콜을 통해 인슐린 생산 세포 (IPCs) 계통을 향한 단리된 Ad-MSCs의 분화를 유도하였다. IPCs 분화는 먼저 생성된 IPCs에 대한 디티존 염색뿐만 아니라 MafA, NKX6.1, Pdx-1 및 Ins1과 같은 특이적 β세포 마커의 발현 수준을 측정함으로써 유전적으로 평가되었다. 둘째로, 평가는 또한 글루코스-자극된 인슐린 분비 (GSIS) 검정에 의해 기능적으로 수행되었다. 결론적으로, Ad-MSC는 모든 MSC 특성화 기준을 제시하여 쉽게 분리 될 수 있으며 당뇨병 연구를위한 실험실에서 풍부하고 재생 가능한 IPC 소스를 실제로 제공 할 수 있습니다.
Introduction
중간엽 기질 세포로도 알려진 중간엽 줄기 세포 (MSCs)는 재생 의학 1,2에 가장 널리 사용되는 세포 유형 중 하나입니다. 이들은 성체줄기세포로 분류되며 다계보 분화 가능성과 자가재생능력을 특징으로한다3. 중간엽 줄기세포는 지방 조직, 골수, 말초 혈액, 탯줄 조직 및 혈액, 모낭 및 치아 4,5를 포함하는 다양한 공급원으로부터 단리되고 수득될 수 있다.
지방 조직으로부터 줄기 세포를 분리하는 것은 쉬운 접근, 시험관 내에서의 빠른 팽창 및 높은 수율6으로 인해 매력적이고 유망한 것으로 간주됩니다. 지방조직 유래 중간엽 줄기세포(Ad-MSCs)는 인간, 소, 생쥐, 래트 및 보다 최근에는 염소7과 같은 상이한 종으로부터 분리될 수 있다. Ad-MSC는 이제 조직 공학 및 유전자 / 세포 요법의 잠재적 인 후보자이며 연조직 손상 또는 결함 7,8의 장기적인 복구를위한 자가 대안을 개발하는 데에도 사용할 수 있음이 입증되었습니다.
국제 세포 및 유전자 치료 학회 (ISCT)는 완전한 특성화를 위해 MSC가 전시해야하는 세 가지 최소 기준을 정의했습니다9. 첫째, 그들은 플라스틱 지지자이어야합니다. 둘째, 중간엽 줄기세포 표면 마커, 예컨대 CD73, CD90, 및 CD105를 발현하고 조혈 마커 CD45, CD34, CD14 또는 CD11b, CD79α 또는 CD19, 및 HLA-DR의 발현이 결여되어야 한다. 마지막으로, MSCs는 세 개의 중간엽 혈통으로 분화 할 수있는 능력을 나타내야합니다 : 지방세포, 골세포 및 연골 세포. 흥미롭게도, MSCs는 또한 신경 세포, 심근 세포, 간세포 및 상피 세포10,11과 같은 다른 혈통으로 분화 할 수 있습니다.
사실, MSC는 다른 질병에 대한 재생 요법에서 잠재적 인 치료제로 적용 될 수있는 독특한 특성을 가지고 있습니다. MSCs는 치료 이점을 제공하는 면역조절 환경을 유도하기 위해 가용성 인자를 분비할 수 있다(12). 또한, MSCs는 표적 치료를 전달하기 위해 손상 부위 및 종양 미세 환경으로 이동할 수 있습니다. 그러나, 메카니즘은 완전히 해명되지 않았다(13). 또한, MSCs는 비코딩 RNAs, 단백질 및 가용성 인자의 화물을 운반하는 나노스케일에서 엑소좀, 세포밖 소포를 분비하는 능력을 가지며, 이는 최근 다양한 질병에서 MSCs의 치료 잠재력의 새로운 메카니즘으로서 등장한다14.
더욱 중요하게는, MSCs는 유전자 변형(15,16) 또는 시험관내 배양 배지 내의 다양한 외인성 유도 인자를 이용함으로써 인슐린 생산 세포(IPCs)로 분화할 수 있는 그들의 잠재력에 대해 뚜렷한 관심을 불러일으켰다. IPC 유도 기간은 사용 된 유도 프로토콜 및 활용 된 외인성 요인에 따라 다르기 때문에 크게 다릅니다. 분화 과정은 며칠에서 수개월까지 지속될 수 있으며, 다른 단계에서 추가 및 / 또는 철회되어야하는 외인성 유도 인자의 조합이 필요합니다. 내분비 췌장 분화에 사용 된 이러한 요인 중 많은 부분은 인슐린 분비 β 세포의 증식 또는 분화 / 신 생성을 촉진하고 IPC18,19,20,21의 인슐린 함량을 증가시키는 것으로 밝혀진 생물학적 활성 화합물입니다. MSCs가 또한 그들의 분비물을 포함한 여러 메커니즘을 통해 당뇨병과 그 합병증에 치료 효과가있는보고뿐만 아니라 면역 조절 작용의 광범위한 배열22,23,24 인 것으로 여기에서 주목할 만하다.
이 프로토콜에서, 우리는 래트 부고환 지방으로부터 Ad-MSCs의 분리 및 특성화를 위한 상세한 단계적 프로토콜을 제시하고, 이어서 Ad-MSCs로부터 IPCs의 생성을 위한 간단하고 비교적 짧은 프로토콜이 뒤따른다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서, 우리는 쥐 부고환 지방으로부터 Ad-MSCs의 분리 및 이러한 Ad-MSCs를 IPCs로 분화시키는 상세한 프로토콜을 제시 할 수 있었다. 사실, 쥐 epidydimal 지방은 Ad-MSCs를 얻기 위해 지방 조직의 쉽게 얻을 수있는 원천이며 수집 또는15,26,27 처리를 위해 특별한 장비가 필요하지 않습니다. 단리된 Ad-MSCs는 우수한 배양 확장을 …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 쥐의 해부를 돕는 Dr. Rawda Samir Mohamed, MSc, Veterinarian Specialist, 약학 학부, 이집트 영국 대학 (BUE)을 인정합니다.
우리는 또한이 원고의 비디오 제작 및 편집을위한 이집트의 영국 대학 (BUE)의 매스 커뮤니케이션 학부의 노력을 인정하고 감사하고 싶습니다.
우리는 미스 Fatma Masoud, 석사, 영어의 보조 강사, 이집트의 영국 대학 (BUE) 원고의 개정 및 영어 교정에 감사드립니다.
이 연구는 약물 연구 개발 센터 (CDRD), 약학 학부, 이집트 영국 대학 (BUE), 카이로, 이집트에서 부분적으로 자금을 지원했습니다.
Materials
| Albumin, bovine serum Fraction V | MP Biomedicals | ||
| Alcian Blue 8GX | Sigma-Aldrich, USA | A3157 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich, USA | A5533 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific, Germany | ||
| Antibody for Rat CD90, FITC | Stem Cell Technologies | 60024FI | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3912 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| CD105 Monoclonal Antibody, FITC | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | MA1-19594 | |
| CD34 Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | PA5-85917 | |
| Chloroform | Fisher Scientific, USA | ||
| Collagenase type I, powder | Gibco, Thermo Fisher, USA | 17018029 | |
| D-Glucose anhydrous, extra pure | Fisher Scientific, Germany | G/0450/53 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific, Germany | BP231-100 | |
| Dithizone staining | Sigma-Aldrich, USA | D5130 | |
| DMEM – High Glucose 4.5 g/L | Lonza, Switzerland | 12-604F | |
| DMEM – Low Glucose 1 g/L | Lonza, Switzerland | 12-707F | |
| DMEM/F12 medium | Lonza, Switzerland | BE12-719F | |
| DNAse/RNAse free water | Gibco Thermo Fisher, USA | 10977-035 | |
| Ethanol absolute, Molecular biology grade | Sigma-Aldrich, Germany | 24103 | |
| Exendin-4 | Sigma-Aldrich, Germany | E7144 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Thermo Fisher, Brazil | 10270-106 | |
| Formaldehyde 37% | Fisher Scientific | ||
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Isopropanol, Molecular biology grade | Fisher Scientific, USA | BP2618500 | |
| L-Glutamine | Gibco Thermo Fisher, USA | 25030-024 | |
| Magnesium Chloride (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit | R&D systems Inc., MN, USA | SC006 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Germany | N0636 | |
| Oil Red Stain | Sigma-Aldrich, USA | O0625 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin | Gibco Thermo Fisher, USA | 15240062 | |
| Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg | Lonza, Switzerland | BE17-516F | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Rat Insulin ELISA Kit | Cloud-Clone Corp., USA | CEA682Ra | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| SYBR Green Maxima | Thermo Scientific, USA | K0221 | |
| Syringe filter, 0.2 micron | Corning, USA | 431224 | |
| TRIzol | Thermo Scientific, USA | 15596026 | |
| Trypan blue | Gibco Thermo Fisher, USA | 15250061 | |
| Trypsin-Versene-EDTA, 1X | Lonza, Switzerland | CC-5012 | |
| Verso cDNA synthesis kit | Thermo Scientific, USA | AB-1453/A | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Germany | M3148 |
Referencias
- Hmadcha, A., Martin-Montalvo, A., Gauthier, B. R., Soria, B., Capilla-Gonzalez, V. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cancer therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 43 (2020).
- Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H., Haider, K. H. Sources and therapeutic strategies of mesenchymal stem cells in regenerative medicine. Handbook of Stem Cell Therapy. , 1-28 (2022).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- De Ugarte, D. A., et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow. Immunology Letters. 89 (2-3), 267-270 (2003).
- Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: A user’s guide. Stem Cells and Development. 19 (10), 1449-1470 (2010).
- Camara, B. O. S., et al. Differentiation of canine adipose mesenchymal stem cells into insulin-producing cells: Comparison of different culture medium compositions. Domestic Animal Endocrinology. 74, 106572 (2021).
- Ren, Y., et al. Isolation, expansion, and differentiation of goat adipose-derived stem cells. Research in Veterinary Science. 93 (1), 404-411 (2012).
- Vallee, M., Cote, J. F., Fradette, J. Adipose-tissue engineering: Taking advantage of the properties of human adipose-derived stem/stromal cells. Pathologie Biologie. 57 (4), 309-317 (2009).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387 (2016).
- Dai, R., Wang, Z., Samanipour, R., Koo, K. I., Kim, K. Adipose-derived stem cells for tissue engineering and regenerative medicine applications. Stem Cells International. 2016, 6737345 (2016).
- Ceccarelli, S., Pontecorvi, P., Anastasiadou, E., Napoli, C., Marchese, C. Immunomodulatory effect of adipose-derived stem cells: The cutting edge of clinical application. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 236 (2020).
- Karp, J., Leng Teo, G. Mesenchymal stem cell homing: The devil is in the details. Cell Stem Cell. 4 (3), 206-216 (2009).
- Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Lopez, M. J., Spencer, N. D. In vitro adult rat adipose tissue-derived stromal cell isolation and differentiation. Methods in Molecular Biology. 702, 37-46 (2011).
- Karnieli, O., Izhar-Prato, Y., Bulvik, S., Efrat, S. Generation of insulin-producing cells from human bone marrow mesenchymal stem cells by genetic manipulation. Stem Cells. 25 (11), 2837-2844 (2007).
- Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131 (2018).
- Lee, R. H., et al. Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17438-17443 (2006).
- Gao, L. R., et al. Overexpression of apelin in Wharton’s jelly mesenchymal stem cell reverses insulin resistance and promotes pancreatic β cell proliferation in type 2 diabetic rats. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 339 (2018).
- Ghoneim, M. A., Refaie, A. F., Elbassiouny, B. L., Gabr, M. M., Zakaria, M. M. From mesenchymal stromal/stem cells to insulin-producing cells: Progress and challenges. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (6), 1156-1172 (2020).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -. L. G., El-Mesallamy, H. O. Exendin-4 enhances the differentiation of Wharton’s jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells through activation of various β-cell markers. Stem Cell Research & Therapy. 7, 108 (2016).
- Yang, Z., Li, K., Yan, X., Dong, F., Zhao, C. Amelioration of diabetic retinopathy by engrafted human adipose-derived mesenchymal stem cells in streptozotocin diabetic rats. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 248 (10), 1415-1422 (2010).
- Zhang, N., Li, J., Luo, R., Jiang, J., Wang, J. A. Bone marrow mesenchymal stem cells induce angiogenesis and attenuate the remodeling of diabetic cardiomyopathy. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes. 116 (2), 104-111 (2008).
- Zhao, A. G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia. Stem Cells International. 2020, 8898221 (2020).
- Krishnamurthy, H., Cram, L. S. Basics of flow cytometry. Applications of Flow Cytometry in Stem Cell Research and Tissue. , 1-12 (2010).
- Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. A. Exendin-4 enhances osteogenic differentiation of adipose tissue mesenchymal stem cells through the receptor activator of nuclear factor-kappa B and osteoprotegerin signaling pathway. Journal of Cellular Biochemistry. , (2022).
- Qi, Y., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells from obese mice prevent body weight gain and hyperglycemia. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 277 (2021).
- Tiryaki, T., Conde-Green, A., Cohen, S. R., Canikyan, S., Kocak, P. A 3-step mechanical digestion method to harvest adipose-derived stromal vascular fraction. Plastic and Reconstructive Surgery – Global Open. 8 (2), 2652 (2020).
- Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: Enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).
- Taghizadeh, R. R., Cetrulo, K. J., Cetrulo, C. L. Collagenase impacts the quantity and quality of native mesenchymal stem/stromal cells derived during processing of umbilical cord tissue. Cell Transplantation. 27 (1), 181-193 (2018).
- Kamal, M. M., Kassem, D. H. Therapeutic potential of Wharton’s jelly mesenchymal stem cells for diabetes: Achievements and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 16 (2020).
- Gabr, M. M., et al. From human mesenchymal stem cells to insulin-producing cells: Comparison between bone marrow- and adipose tissue-derived cells. BioMed Research International. 2017, 3854232 (2017).
- Xin, Y., et al. Insulin-producing cells differentiated from human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro ameliorate streptozotocin-induced diabetic hyperglycemia. PLoS One. 11 (1), 0145838 (2016).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M. Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: A meta-analysis study. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 484 (2020).
- El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., El Mesallamy, H. O. A comparison of Wharton’s jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy. Regenerative Medicine. 10 (7), 841-855 (2015).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -. L. G., El-Mesallamy, H. O. Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton’s jelly mesenchymal stem cells into insulin producing cells. Biochimie. 127, 187-195 (2016).
- El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. Obestatin can potentially differentiate Wharton’s jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Cell and Tissue Research. 372 (1), 91-98 (2018).
- Gabr, M. M., et al. Insulin-producing cells from adult human bone marrow mesenchymal stromal cells could control chemically induced diabetes in dogs: A preliminary study. Cell Transplantation. 27 (6), 937-947 (2018).
