Kwantificering van reactieve zuurstofsoorten met behulp van 2′,7′-dichlorofluoresceïnediacetaatsonde en flowcytometrie in Müller-gliacellen

Het neurale netvlies is een zeer georganiseerd weefsel dat goed gedefinieerde neuronale lagen presenteert. Hierin zijn neuronen (ganglion,amacrine, bipolaire, horizontale en fotoreceptorcellen) met elkaar verbonden en ook met Müller-gliacellen (MGC’s) en astrocyten, wat leidt tot adequate fototransductie en verwerking van visuele informatie ^1,2. Van MGC’s is bekend dat ze een belangrijke rol spelen bij het onderhoud van retinale homeostase omdat ze het hele retinale gedeelte doorkruisen en dus kunnen interageren met alle celtypen die meerdere beschermende processen moduleren. Er is gemeld dat MGC’s verschillende belangrijke functies hebben voor het onderhoud en de overleving van retinale neuronen, waaronder glycolyse om energie te leveren aan neuronen, de verwijdering van neuronaal afval, de recycling van neurotransmitters en de afgifte van neurotrofe factoren, onder andere ^3,4,5.

Aan de andere kant zijn ontsteking, oxidatieve en nitrosatieve stress betrokken bij de pathogenese en progressie van veel menselijke ziekten, waaronder retinopathieën 6,7,8,9,10,11. De redoxbalans in cellen is afhankelijk van een strakke regulering van ROS-niveaus. ROS worden constant gegenereerd onder fysiologische omstandigheden als gevolg van aërobe ademhaling voornamelijk. De belangrijkste leden van de ^ROS-familie zijn reactieve vrije radicalen zoals het superoxide-anion (O_2͘͘͘͘•−), hydroxylradicalen (^•OH), verschillende peroxiden (ROOR′), hydroperoxiden (ROOH) en het geen radicale waterstofperoxide (H₂O₂)^12,13. In de afgelopen jaren is gebleken dat ROS een belangrijke signaalrol speelt in de cellen door essentiële processen te beheersen. MGC’s hebben een sterke antioxidantafweer door de activering van de transcriptionele nucleaire factor erytroïde-2-gerelateerde factor 2 (Nrf2) en de daaropvolgende expressie van antioxidanteiwitten om de overmatige productie van ROS onder pathologische omstandigheden te elimineren 14,15,16. Wanneer de cellen hun redoxbalans verliezen als gevolg van een overdreven productie van ROS of een defect vermogen om ROS te verwijderen, bevordert de accumulatie van oxidatieve stress schadelijke modificaties in eiwitten, lipiden en DNA, wat leidt tot cellulaire stress of de dood. De toename van het retinale antioxidantafweersysteem verbetert de resolutie en preventie van retinopathieën, zoals ROP en RD 17,18,19,20,21,22,23,24. Daarom is het meten van ROS-productie in real-time een krachtig en nuttig hulpmiddel.

Er zijn verschillende methoden voor het meten van ROS-productie of oxidatieve stress in cellen. Onder deze, 2′,7′-dichlorofluorescein diacetaat (DCFH-DA) sonde is een van de meest gebruikte technieken voor het direct kwantificeren van de redoxtoestand van een cel 25,26,27,28. Deze sonde is lipofiel en niet-fluorescerend. Diffusie van deze sonde over het celmembraan maakt de splitsing mogelijk door intracellulaire esterasen bij de twee esterbindingen, waardoor een relatief polair en celmembraan-ondoordringbaar product ontstaat, 2′,7′-dichlorofluorescein (H₂DCF). Dit niet-fluorescerende molecuul accumuleert intracellulair en daaropvolgende oxidatie door ROS levert het zeer fluorescerende product DCF op. De oxidatie van de sonde is het product van de werking van meerdere soorten ROS (peroxynitriet, hydroxylradicalen, stikstofmonoxide of peroxiden), die kunnen worden gedetecteerd door flowcytometrie of confocale microscopie (emissie bij 530 nm en excitatie bij 485 nm). De beperking van deze techniek is dat superoxide en waterstofperoxide niet sterk reageren met H₂DCF^25,29. In dit artikel gebruiken we DCFH-DA probe om ROS te meten en te kwantificeren door middel van flowcytometrie. Om die reden induceren we ROS-productie door MGC’s te stimuleren met ROS-inductor, A of B, voorafgaand aan het laden van de cellen met de fluorescerende sonde. Daarnaast gebruiken we een antioxidantverbinding. Ten slotte tonen we representatieve en betrouwbare gegevens die met behulp van dit protocol zijn verkregen.