이 프로토콜은 교체 가능한 뚜껑 (R.MIW)이있는 새로운 유방 이미징 창을 설명합니다. R.MIW의 이식 후 생체 내 현미경 검사는 다른 발달 단계에서 세포 해상도로 건강하고 병든 유선의 종방향 및 다일 이미징을 허용합니다.
유선의 분지 구조는 매우 역동적이며 출생 후 성장과 리모델링의 여러 단계를 거칩니다. 피부 플랩 수술 또는 이미징 창문의 이식과 함께 생체 내 현미경 검사는 다양한 발달 단계에서 건강한 유선의 역학을 연구하는 데 사용되었습니다. 대부분의 유방 영상 기술은 수시간에서 며칠의 기간으로 제한되는 반면, 유선 리모델링 과정의 대부분은 며칠에서 몇 주까지의 시간 프레임으로 발생합니다. 유선의 리모델링을 연구하기 위해서는 연장된 기간 동안 관심 조직에 광학적으로 접근할 수 있는 방법이 필요하다. 여기에서, 교체 가능한 뚜껑(R.MIW)을 갖는 티타늄 유방 이미징 윈도우의 개선된 버전이 최대 몇 주 동안 세포 해상도로 유선의 고해상도 이미징을 가능하게 하는 것에 대해 설명한다. 중요하게도, R.MIW는 생체내 영상화 실험의 전체 기간에 걸쳐 조직 접근을 제공하며, 따라서 국소 조직 조작, 표지, 약물 투여 또는 이미지 유도 미세 해부에 사용될 수 있다. 종합하면, R.MIW는 유선 발달, 항상성 및 질병 동안 세포 역학의 고해상도 특성화를 가능하게합니다.
유방 상피는 포유류에 존재하는 독특한 분비 기관으로, 자손에게 영양을 공급하기 위해 우유를 생산하고 분비합니다. 평생 동안, 유선은 조직의 구조적 및 기능적 변화를 동반하는 여러 차례의 발달과 성장을 겪습니다1. 발달 단계에 따라 조직 리모델링에 기여하는 세포 유형은 덕트 트리 내의 위치뿐만 아니라 다릅니다.
다중 광자 내 생명 현미경 (IVM)은 네이티브 및 최소 교란 설정 2,3,4에서 생체 내에서 유방 세포 역학의 연구를 허용합니다. 유선에 대한 시각적 접근을 얻기 위해, 사춘 기 4,5,6,7, 성인기 2,8, 수유9,10,11,12 및 종양 역학 13,14를 포함하여 유선 발달의 여러 단계에서 몇 가지 일시적인 생체 외 또는 피부 플랩 이미징 기술이 발표되었습니다. ,15. 이러한 기술은 유방 세포 역학의 공간적 및 시간적으로 해결 된 높은 이미징을 초래하지만, 대부분의 유선의 리모델링 과정은 며칠에서 몇 주가 걸리는 반면, 시간 프레임은 시간으로 제한됩니다. 따라서, 연장된 시간 프레임 동안 관심 조직에 대한 광학적 접근을 허용하는 방법이 요구된다. 수년에 걸쳐, 티타늄 유방 영상 창 (MIW)2,3,19를 포함하여 유방 종양 이미징 15,16,17,18을 위해 몇 가지 영구 이미징 창이 개발되었습니다. 유방 종양 성장을 연구하는 데 매우 유용하지만, 건강한 유선 구조의 시각화는 며칠로 제한되었습니다. 최근에는 유연한 실리콘 이미징 창이 개발되어20 주 동안 사춘기 유선을 시각화 할 수 있습니다. 그러나 유선은 지방세포가 풍부한 지방 패드에 매립되어 광범위한 광산란을 일으키고 결과적으로 유방 덕트 구조의 가시성을 제한합니다. 따라서 유선에서 장기간에 걸친 조직 역학을 시각화하기 위해서는 항상 우수한 이미징 조건이 필요합니다. 고전적인 MIW나 유연한 실리콘 창은 수술 및 이식 후 창이 닫힌 시스템을 형성하기 때문에 이미징 전에 조직 조작 또는 물리적 조직 위치 최적화를 허용하지 않습니다. 결과적으로, 근본적인 유방 조직에 대한 최적의 광학 접근은 더 긴 기간에 걸쳐 배제 될 가능성이 큽니다. 대조적으로, 피부 플랩 기술은 이미징 세션 동안 조직의 최적화 및 재배치를 허용하고, 피부 플랩은2회 여러 번 반복될 수 있다. 그러나 피부 플랩을 통한 반복적 인 이미징 세션은 피부의 회복을 허용하기 위해 수술 사이에 충분한 시간 (최소 7 일)이 할당 될 때만 가능하므로 더 긴 시간 척도에서 프로세스를 연구하는 데 주로 적합합니다. 또한, 침습적 인 성격과 상처 폐쇄시 감염 및 흉터의 위험이 크기 때문에이 절차를 여러 번 수행하지 않는 것이 좋습니다.
이러한 한계를 극복하기 위해, 즉 고주파에서 장기간 동안 최적의 이미징 조건을 보장함과 동시에 조직 조작을 허용하기 위해, 교체 가능한 뚜껑(R.MIW)을 갖는 MIW의 개선된 티타늄 버전은 2주까지 여러 날에서2 주에 걸쳐 건강하고 병든 유선을 시각화하도록 설계되었다(도 1A, B). R.MIW는 IVM 실험의 전체 기간 동안 직접 조직 조작을 가능하게하는 최적의 조직 접근을 제공하도록 맞춤 설계되었으므로 장기간에 걸쳐 적절한 시간과 장소에서 유선의 시각화를 허용합니다. R.MIW가 닫히면 기존 MIW에 필적하는 밀폐 시스템을 형성합니다(그림 1C). 무균 조건 하에서 개방될 때, R.MIW는 국소 조직 조작을 허용하여 광학 접근을 개선하고, 또한 경로 억제제 또는 작용제와 같은 물질의 국소 투여, 암 세포 또는 면역 세포 집단과 같은 관심있는 다른 세포 유형의 주입 또는 조직 표지 염료의 첨가를 가능하게 한다. 뚜껑은 이미징 세션 사이에 언제든지 열 수 있으며 기본 조직에 손상을 입히지 않습니다.
그림 1: 교체 가능한 뚜껑이 있는 유방 이미징 창 디자인. (A) 링에 접착된 10mm 커버글래스가 있는 유방 이미징 창의 교체 가능한 뚜껑의 상단도 및 측면도. (b) 지갑 끈 봉합사를 사용하여 마우스의 피부 내에 창을 고정시키기 위해 외부 링과 그 사이에 홈이있는 내부 링으로 구성된 유방 이미징 창의 상면도 및 측면도. 외부 링에는 뚜껑의 네 개의 돌기 (팔)에 맞는 작은 홈이 있습니다. (C) 뚜껑의 개폐 메커니즘을 보여주는 만화 및 그림. 기울어진 돌출부는 뚜껑이 창틀 내부에 고정되어 있는지 확인합니다. 이 그림은 Messal et al. 2에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 프로토콜은 R.MIW의 설계 및 이식 절차뿐만 아니라 세포 해상도에서 동일한 유방 덕트 및 시각화를 다시 방문하기위한 종단 IVM 전략을 설명합니다. R.MIW는 다양한 형광 리포터 마우스 모델에서 유선의 다양한 발달 단계에서 세포 분열 및 형태 학적 변화를 따라갈 수 있습니다. 종합하면, R.MIW는 유선의 발달, 항상성 및 질병 동안 세포 역학의 고해상도 특성화를 용이하게합니다.
R.MIW는 원산지 및 최소한의 교란 환경에서 건강하고 병든 유선의 종방향 이미징을 허용하고 다양한 발달 단계에서 유선의 반복적 인 시각화를 허용합니다. R.MIW 설계를 사용하면 실험 중 언제든지 창을 열 수 있습니다. 관심 조직에 대한 장기간의 시각적 접근은, 예를 들어, 커버슬립 상의 세포 파편의 축적에 의해 방해될 수 있다. 이러한 경우, R.MIW는 이미징 세션 전후에 열리면 전체 가시적 인 조직 영역과 뚜껑을 청소할 수 있습니다. 탈착식 뚜껑은 또한 조직의 조작뿐만 아니라 특정 억제제 및 치료법, 라벨링 염료 또는 관심있는 특정 세포 유형과 같은 물질의 국소 적용을 허용합니다.
이 방법은 하나의 이미징 세션으로 제한되는 앞서 설명한 유방 스킨플랩 절차 4,7,8,13의 한계를 극복하고 분지화 형태형성(그림 5), 항상성 조직 회전율(그림 6) 또는 세포 수준에서의 종양 성장(그림 3B)과 같은 과정을 시각화할 수 있습니다. ). 그러나 동시에, R.MIW는 이미징 세션 사이에 조직의 로컬 조작을 허용하며, 이는 이전에 공개된 MIW 3,18 및 다른 모든 이미징 윈도우20,22에 비해 R.MIW의 큰 자산을 포함한다. R.MIW를 열 때 감염원을 예방하기 위해 항상 무균 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 무균 환경에서 R.MIW를 열 수 있는 기능은 모든 이미징 세션 전에 이미징 조건을 최적화할 수 있게 해주며, 이는 관심 조직에 대한 장기적인 시각적 접근을 크게 향상시킵니다. 특히, 지방세포가 풍부한 스트로마에 매립 된 유선에서 이것은 큰 가치가 있습니다. 더욱이, 교체가능한 뚜껑은 IVM 실험을 종료할 필요 없이 치료제, 상이한 세포 유형, 라벨링 염료, 이미지-유도 미세 해부 또는 임의의 다른 국소 조직의 국소 조작의 국소 투여를 고유하게 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 종양 개시를 연구하기 위해, 특정 암 세포 집단은 R.MIW 링을 통해 ROI에 접근 가능한 한, 결정된 IVM 시점 및 정확한 유선(mammary gland) 위치에서 덕트 트리 또는 스트로마에 직접 주사될 수 있다. 종양 진행을 연구하기 위해, 특정 암 세포 집단 (특정 위치에서, 특정 미세 환경에서, 또는 특정 거동을 가진)은 IVM 세션 동안 광-마킹될 수 있고, 이어서 R.MIW의 개봉 후에 형광 해부 현미경을 사용하여 미세 해부될 수 있었다. 단리된 세포는 (단일세포) mRNA 시퀀싱과 같은 하류 분석을 위해 추가로 처리될 수 있었다. 이러한 접근법을 사용함으로써, 생체내 세포 거동을 분자 발현 프로파일에 결합시킬 수 있다. R.MIW에 의해 활성화된 국소 약물 투여의 이점은 치료 전후에 조직을 영상화할 수 있게 한다. 이미징 박스로부터 마우스를 제거하고 R.MIW 뚜껑을 연 후 국소 약물 투여를 후속적으로 수행하는 데 필요한 간격은 몇 분 안에 수행될 수 있으며, 이는 빠른 작용 약물의 즉각적인 위상 포획을 허용한다.
우리는 R.MIW를 통한 유선의 IVM이 많은 상이한 형광 리포터 마우스 모델과 양립가능하다는 것을 보여준다. 지방이 풍부한 환경은 이미지에 어려움을 겪고 있으므로 밝은 형광단을 사용하는 것이 좋습니다. 그러나, 여기에 나타낸 바와 같이, mCFP와 같은 덜 밝은 형광단은 최적의 이미징 조건에서 R.MIW를 통해 시각화될 수 있다. 필연적으로, 지방 패드는 더 깊은 덕트 구조의 이미징을 배제하고 이미징을보다 피상적 인 덕트로 제한합니다. 각 IVM 실험 시작 시 저해상도 개요 이미지는 고해상도 이미징에 충분히 피상적인 관심 있는 덕트 구조를 식별하는 데 도움이 됩니다. R.MIW를 연 후 국소 조직 조작, 결합 조직 제거 또는 지방 조직의 재배치는 지방 조직에 의해 오버레이되는 특정 ROI에 대해 IVM을 최적화 할 수 있습니다. 이는 이전의 모든 창 설계에 비해 중요한 장점으로, 이러한 조작을 수행 할 수 없으며 창 자체를 완전히 제거해야합니다. 특히, 사타구니 림프절의 시각화를 위해, 광 산란을 줄이고 고해상도 이미징을 가능하게하는 위에 놓인 지방 조직을 부드럽게 제거하는 것이 좋습니다. 조직을 조작 할 때 IVM 실험 중에 연구되는 과정에 영향을 줄 수 있으므로 항상 무균 상태를 유지하고 출혈이나 조직의 심각한 손상을 예방하십시오.
R.MIW는 관절이나 뼈 판과 같은 경질 조직을 대체하기 위해 임상 실습에서 일반적으로 사용되는 물질인 티타늄으로 만들어졌습니다. 티타늄은 가볍고 불활성 인 문자21을 포함하여 강철 창문에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 최근에, 가요성 실리콘 윈도우(20)를 포함하는 신규한 이미징 윈도우 타입들을 생성하기 위해 몇몇 다른 재료들이 사용되었다. R.MIW와는 달리, 유연한 창은 이식을 위해 봉합사를 필요로하지 않으며 거의 모든 해부학 적 위치, 특히 부드럽고 깨지기 쉬운 조직의 경우에 적합합니다. 실리콘 창은 가볍고 변형 가능한 특성으로 인해 동물의 운동성에 최소한의 영향을 미치며 빠른 조직 확장 및 성장을 연구하는 실험에 더 적합 할 수 있습니다20. 티타늄 버전에 비해 또 다른 장점은 실리콘 윈도우가 자기 공명 이미징20,27을 포함한 다른 이미징 양식과 호환된다는 것입니다. 그러나 목표는 0.17mm 유리 커버 슬립에 최적화되어 있음을 명심하는 것이 중요합니다. 또한, 유방 조직은 호흡 운동에 취약하며, 특히 거꾸로 된 현미경을 사용할 때 유연한 창을 사용하여 제한하기가 어렵습니다. 호흡 아티팩트는 R.MIW 설계와 이미징 박스의 인레이에 R.MIW의 고정에 의해 최소화됩니다. 결과적으로 제안된 R.MIW 설정을 사용하여 획득한 이미지는 호흡 아티팩트로 인해 왜곡되지 않습니다. 그러나, 조직 국소화에서 경미한 드리프트가 발생할 수 있으며, 이는 일반적으로 점진적이며, 사후 획득 모션 보정 소프트웨어(28)를 사용하여 보정될 수 있다. IVM 기술2,20의 툴박스가 증가함에 따라, 각 실험에 대한 특정 요건은 결국 관심 조직의 생체내 시각화의 가장 좋은 방법을 결정할 것이다. 다른 창 디자인은 서로 다른 장점과 단점을 가지고 있으며 연구 질문, 사용 가능한 현미경 설정, 필요한 공간 및 시간 분해능 및 연구 된 프로세스의 총 시간 범위에 따라 최적의 접근 방식을 결정해야합니다.
요약하면, R.MIW는 수일에서 수주에 걸쳐 유선 발달, 항상성 및 질병 동안 세포 역학의 고해상도 특성화를 용이하게합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 연구 재단 플랑드르 (M.C.에 기초 연구 11L7222N을 수여하는 박사 학위), Boehringer Ingelheim Foundation (C.L.G.J.S.에 박사 펠로우십), EMBO 박사 후 펠로우십 (ALTF 1035-2020을 C.L.G.J.S.에 부여), Josef Steiner Award (J.V.R)의 지원을 받았습니다.
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