Diferenciación robusta de iPSCs humanas en una población pura de adipocitos para estudiar trastornos asociados a adipocitos
Summary
El protocolo permite la generación de una población de adipocitos puros a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). El ácido retinoico se utiliza para diferenciar las iPSC en células madre mesenquimales (MSC) que se utilizan para producir adipocitos. Luego, se utiliza un enfoque de clasificación basado en la tinción de rojo del Nilo para obtener adipocitos puros.
Abstract
Los avances recientes en la tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) han permitido la generación de diferentes tipos de células, incluidos los adipocitos. Sin embargo, los métodos de diferenciación actuales tienen baja eficiencia y no producen una población homogénea de adipocitos. Aquí, evitamos este problema mediante el uso de un método basado en retinoico totalmente trans para producir células madre mesenquimales (MSC) en alto rendimiento. Al regular las vías que gobiernan la proliferación, supervivencia y adhesión celular, nuestra estrategia de diferenciación permite la generación eficiente de cuerpos embrionarios (EB) que se diferencian en una población pura de MSC multipotentes. El alto número de MSCs generadas por este método proporciona una fuente ideal para generar adipocitos. Sin embargo, la heterogeneidad de la muestra resultante de la diferenciación de los adipocitos sigue siendo un desafío. Por lo tanto, utilizamos un método basado en rojo del Nilo para purificar los adipocitos maduros que contienen lípidos mediante FACS. Esta estrategia de clasificación nos permitió establecer una forma confiable de modelar los trastornos metabólicos asociados a los adipocitos utilizando un grupo de adipocitos con heterogeneidad reducida de la muestra y funcionalidad celular mejorada.
Introduction
Las células madre mesenquimales (MSC) actúan como un recurso transitorio eficaz para producir células de origen mesodérmico como adipocitos, osteocitos y condrocitos, que podrían usarse para modelar sus respectivos trastornos genéticos. Sin embargo, los enfoques anteriores se basaron en la obtención de estas MSC a partir de tejidos adultos 1, lo que impuso el desafío de obtenerlas en grandes cantidades de los donantes, y la limitación de mantenerlas funcionalmente viables en condiciones de cultivo in vitro subóptimas 1,2. Estos obstáculos han producido una gran demanda de contar con un protocolo para generar MSCs in vitro. Las células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSCs) pueden ser utilizadas como una valiosa fuente de MSCs, exhibiendo características MSC 3,4,5. Las MSC derivadas de iPSCs se pueden utilizar como una opción terapéutica en varias enfermedades. Además, la capacidad de las MSC derivadas de iPSCs para generar adipocitos, las convierte en un valioso modelo humano in vitro para estudiar la adipogénesis humana, la obesidad y los trastornos asociados a los adipocitos.
Los protocolos actuales de diferenciación de los adipocitos se pueden clasificar en dos grupos, uno que implica la diferenciación de los adipocitos utilizando cócteles químicos o basados en proteínas que dan un rendimiento resultante de 30%-60%6,7,8,9, mientras que el otro implica la manipulación genética para la inducción robusta de factores de transcripción clave que rigen el desarrollo de los adipocitos para dar un rendimiento del 80%-90%10, 11. Sin embargo, la manipulación genética no recapitula el proceso natural de diferenciación de los adipocitos, y a menudo enmascara los paradigmas sutiles que llegan durante la adipogénesis, haciéndola ineficaz para fines de modelado de enfermedades12,13. Por lo tanto, presentamos una forma de clasificar los adipocitos maduros derivados químicamente de los inmaduros marcando fluorescentemente los adipocitos que contienen lípidos utilizando rojo del Nilo.
Aquí presentamos un protocolo que involucra la incubación transitoria de cuerpos embrioides (EB) derivados de iPSCs con ácido todo-trans retinoico para producir un alto número de MSCs de rápida proliferación, que podrían ser utilizados para generar adipocitos14. También presentamos una forma de clasificar los adipocitos maduros derivados químicamente del grupo de diferenciación heterogénea marcando fluorescentemente sus gotas de lípidos utilizando un colorante lipofílico; Rojo del Nilo. Esto permitiría la generación de una población pura de adipocitos maduros con funcionalidad mejorada para modelar con precisión los trastornos metabólicos asociados a los adipocitos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo tiene una importancia primordial debido a su capacidad para proporcionar MSC en alto rendimiento y eficiencia. Esta producción a gran escala de MSC fue posible gracias a la incubación transitoria de EB derivadas de iPSCs con 10 μM de RA14,15. El tratamiento transitorio con 10 μM de AR mejoró el rendimiento de MSC de 11,2 a 1542 veces14,15, siendo este protocolo aplicable tanto en iPSCs…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por una subvención del Fondo Nacional de Investigación de Qatar (QNRF) (Subvención No. NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi fue apoyada por la beca GSRA del Fondo Nacional de Investigación de Qatar (QNRF).
Materials
| Adiponectin | Abcam | ab22554 | Adipocyte maturation marker |
| anti-CD105 | BD Pharmingen | 560839 | MSC differentiation marker |
| anti-CD14 | BD Pharmingen | 561712 | MSC differentiation marker |
| anti-CD19 | BD Pharmingen | 555415 | MSC differentiation marker |
| anti-CD34 | BD Pharmingen | 555824 | MSC differentiation marker |
| anti-CD44 | abcam | ab93758 | MSC differentiation marker |
| anti-CD45 | BD Pharmingen | 560975 |
MSC differentiation marker |
| anti-CD73 | BD Pharmingen | 550256 | MSC differentiation marker |
| anti-CD90 | BD Pharmingen | 555596 | MSC differentiation marker |
| bFGF | R&D | 233-FP | MSC culture media supplement |
| C/EBPA | Abcam | ab40761 | Adipocyte maturation marker |
| Dexamethasone | Torics | 1126 | Adipocyte differentiation media supplement |
| FABP4 | Abcam | ab93945 | Adipocyte maturation marker |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10082147 | MSC culture media supplement |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050-061 | MSC culture media supplement |
| IBMX | Sigma Aldrich | I5879 | Adipocyte differentiation media supplement |
| Indomethacin | Sigma Aldrich | I7378 | Adipocyte differentiation media supplement |
| Insulin | Sigma Aldrich | 91077C | Adipocyte differentiation media supplement |
| Knockout DMEM | ThermoFisher | 12660012 | Basal media for preparing matrigel |
| Low glucose DMEM | ThermoFisher | 11885084 | MSC culturing media |
| Matrigel | Corning | 354230 | Coating matrix |
| MEM-alpha | ThermoFisher | 12561056 | Adipocyte differentiation media |
| Nilered | Sigma Aldrich | 19123 | Sorting marker for adipocyte |
| Penicillin | ThermoFisher | 15140122 | MSC/Adipocyte media supplement |
| Phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190144 | wash buffer |
| Pierce™ 20X TBS Buffer | Thermo Fisher | 28358 | wash buffer |
| PPARG | Cell Signaling Technology | 2443 | Adipocyte maturation marker |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Dissociation reagent |
| Retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625 | MSC differentiation media supplement |
| Rock inhibitor | Tocris | 1254/10 | hPSC culture media supplement |
| Roziglitazone | Sigma Aldrich | R2408 | Adipocyte differentiation media supplement |
| StemFlex | ThermoFisher | A334901 | hPSC culture media |
| Triton | Thermo Fisher | 28314 | Permebealization reagent |
| Trypsin | ThermoFisher | 25200072 | Dissociation reagent |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7942 | Wash buffer |
Referencias
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling: CCS. 9, 12 (2011).
- Wagner, W., et al. Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells. PLoS One. 4 (6), 5846 (2009).
- Brown, P. T., Squire, M. W., Li, W. J. Characterization and evaluation of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells and bone marrow. Cell and Tissue Research. 358 (1), 149-164 (2014).
- Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Experimental Hematology. 36 (3), 350-359 (2008).
- Barberi, T., Willis, L. M., Socci, N. D., Studer, L. Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells. PLoS Medicine. 2 (6), 161 (2005).
- Xiong, C., et al. Derivation of adipocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (6), 671-675 (2005).
- Cuaranta-Monroy, I., et al. Highly efficient differentiation of embryonic stem cells into adipocytes by ascorbic acid. Stem Cell Research. 13 (1), 88-97 (2014).
- van Harmelen, V., et al. Differential lipolytic regulation in human embryonic stem cell-derived adipocytes. Obesity (Silver Spring). 15 (4), 846-852 (2007).
- Noguchi, M., et al. In vitro characterization and engraftment of adipocytes derived from human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 22 (21), 2895-2905 (2013).
- Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
- Lee, Y. K., Cowan, C. A. Differentiation of white and brown adipocytes from human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 538, 35-47 (2014).
- Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (6), 2459-2483 (2021).
- Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
- Karam, M., Younis, I., Elareer, N. R., Nasser, S., Abdelalim, E. M. Scalable Generation of mesenchymal stem cells and adipocytes from human pluripotent stem cells. Cells. 9 (3), (2020).
- Karam, M., Abdelalim, E. M. Robust and highly efficient protocol for differentiation of human pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. , (2020).
- Li, L., Bennett, S. A., Wang, L. Role of E-cadherin and other cell adhesion molecules in survival and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Adhesion & Migration. 6 (1), 59-70 (2012).
- Lai, L., Bohnsack, B. L., Niederreither, K., Hirschi, K. K. Retinoic acid regulates endothelial cell proliferation during vasculogenesis. Development. 130 (26), 6465-6474 (2003).
- Chanchevalap, S., Nandan, M. O., Merlin, D., Yang, V. W. All-trans retinoic acid inhibits proliferation of intestinal epithelial cells by inhibiting expression of the gene encoding Kruppel-like factor 5. FEBS Letters. 578 (1-2), 99-105 (2004).
- di Masi, A., et al. Retinoic acid receptors: from molecular mechanisms to cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 41, 1 (2015).
- Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Letters. 584 (14), 3123-3130 (2010).
- De Angelis, M. T., Parrotta, E. I., Santamaria, G., Cuda, G. Short-term retinoic acid treatment sustains pluripotency and suppresses differentiation of human induced pluripotent stem cells. Cell Death & Disease. 9 (1), 6 (2018).
- Li, L., Dong, L., Wang, Y., Zhang, X., Yan, J. Lats1/2-mediated alteration of hippo signaling pathway regulates the fate of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2018, 4387932 (2018).
- Moldes, M., et al. Peroxisome-proliferator-activated receptor gamma suppresses Wnt/beta-catenin signalling during adipogenesis. The Biochemical Journal. 376, 607-613 (2003).
- Ross, S. E., et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science. 289 (5481), 950-953 (2000).
- Wang, Y. K., Chen, C. S. Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 823-832 (2013).
- Mohsen-Kanson, T., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells into brown and white adipocytes: role of Pax3. Stem Cells. 32 (6), 1459-1467 (2014).
- Billon, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
- Li, N., Kelsh, R. N., Croucher, P., Roehl, H. H. Regulation of neural crest cell fate by the retinoic acid and Pparg signalling pathways. Development. 137 (3), 389-394 (2010).
- Ussar, S., et al. ASC-1, PAT2, and P2RX5 are cell surface markers for white, beige, and brown adipocytes. Science Translational Medicine. 6 (247), (2014).
- Festy, F., et al. Surface protein expression between human adipose tissue-derived stromal cells and mature adipocytes. Histochemistry and Cell Biology. 124 (2), 113-121 (2005).
- Cai, L., Wang, Z., Ji, A., Meyer, J. M., vander Westhuyzen, D. R. Scavenger receptor CD36 expression contributes to adipose tissue inflammation and cell death in diet-induced obesity. PLoS One. 7 (5), 36785 (2012).
- Mesuret, G., et al. A neuronal role of the Alanine-Serine-Cysteine-1 transporter (SLC7A10, Asc-1) for glycine inhibitory transmission and respiratory pattern. Scientific Reports. 8 (1), 8536 (2018).
- Silverstein, R. L., Febbraio, M. CD36, a scavenger receptor involved in immunity, metabolism, angiogenesis, and behavior. Science Signaling. 2 (72), (2009).
- Brooimans, R. A., van Wieringen, P. A., van Es, L. A., Daha, M. R. Relative roles of decay-accelerating factor, membrane cofactor protein, and CD59 in the protection of human endothelial cells against complement-mediated lysis. European Journal of Immunology. 22 (12), 3135-3140 (1992).
- Davies, A., et al. CD59, an LY-6-like protein expressed in human lymphoid cells, regulates the action of the complement membrane attack complex on homologous cells. The Journal of Experimental Medicine. 170 (3), 637-654 (1989).
- Lapid, K., Graff, J. M. Form(ul)ation of adipocytes by lipids. Adipocyte. 6 (3), 176-186 (2017).
- Aldridge, A., et al. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells–a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
- Schaedlich, K., Knelangen, J. M., Navarrete Santos, A., Fischer, B., Navarrete Santos, A. A simple method to sort ESC-derived adipocytes. Cytometry A. 77 (10), 990-995 (2010).
- Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (2), 447-467 (2021).
