Пространственно-височная субклеточная манипуляция цитоскелетом микротрубочек в живом преимплантационном эмбрионе мыши с использованием фотостатинов

Архитектура микротрубочек широко варьируется в разных типах клеток для поддержки различных функций ^1,2. Его динамический характер роста и усадки позволяет быстро адаптироваться к вне- и внутриклеточным сигналам и реагировать на постоянно меняющиеся потребности клетки. Следовательно, его можно рассматривать как «морфологический отпечаток пальца», играющий ключевую роль в клеточной идентичности.

Фармакологическое нацеливание цитоскелета микротрубочек с использованием ингибиторов малых молекул привело к множеству фундаментальных открытий в биологии развития, биологии стволовых клеток, биологии рака и нейробиологии 3,4,5,6,7. Этот подход, хотя и незаменим, сопряжен с различными ограничениями, такими как токсичность и нецелевые последствия. Например, один из наиболее широко используемых микротрубочек-таргетирующих агентов, нокодазол, является мощным микротрубоче-деполимеризующим препаратом⁸. Однако низкомолекулярные ингибиторы, такие как нокодазол, активны с момента применения, и, учитывая сущностную природу цитоскелета микротрубочек для многих критических клеточных функций, глобальная деполимеризация микротрубочек может вызывать нецелевые эффекты, которые могут быть непригодны для многих применений. Кроме того, лечение нокодазолом является необратимым, если образцы не промываются без препарата, что препятствует непрерывной визуализации в реальном времени и, таким образом, точному отслеживанию отдельных нитей микротрубочек.

Разработка светоактивированных соединений началась с создания фотоненасыщенных молекул и ознаменовала новую эру в нацеливании и мониторинге эффектов ингибирования роста микротрубочек точным и пространственно-временно контролируемым образом. Одно семейство обратимо фотопереключаемых препаратов, фотостатины (PST), были разработаны путем замены стилбенового компонента комбретастатина А-4 азобензолом⁹. PST неактивны до освещения ультрафиолетовым светом, в результате чего неактивная трансконфигурация преобразуется в активную цис-конфигурацию путем обратимой изомеризации. Цис-PST ингибируют полимеризацию микротрубочек путем связывания с местом связывания колхицина β-тубулина, блокируя его интерфейс с β-тубулином и предотвращая димеризацию, необходимую для роста микротрубочек¹⁰. Среди когорты PST-1P появился как соединение свинца, поскольку он обладает самой высокой эффективностью, полностью водорастворим и показывает быстрое начало биологической активности после освещения.

Наиболее эффективная транс– и цис-изомеризация PST происходит на длинах волн между 360-420 нм, что обеспечивает двойные варианты активации PST. Лазерная линия 405 нм на типичном конфокальном микроскопе может быть введена для оптимального пространственного нацеливания ингибирования роста микротрубочек. Возможность точно определять местоположение и время активации PST с помощью лазерного освещения 405 нм облегчает точное временное и пространственное управление, позволяя нарушать динамику микротрубочек на субклеточном уровне в течение времени отклика^{менее секунды 9}. В качестве альтернативы, доступный светодиодный ультрафиолетовый свет позволяет освещению всего организма вызывать нарушение архитектуры микротрубочек в масштабах всего организма. Это может быть экономически эффективной альтернативой для исследователей, для которых целью является точно своевременное начало торможения, а не пространственное нацеливание. Еще одной особенностью PST является их инактивация по требованию путем применения зеленого света длины волны^{в диапазоне} 9 510-540 нм. Это позволяет отслеживать нити микротрубочек до, во время и после PST-опосредованного ингибирования роста.

PST, хотя они все еще относительно недавно были разработаны, были использованы в многочисленных приложениях in vitro в различных областях исследований¹¹, включая изучение новых механизмов миграции клеток у амебоидов¹², в нейронах, выделенных из мозга новорожденной мыши¹³, и развитие эпителия крыла у Drosophila melanogaster¹⁴ . Другие светореактивные препараты оказались ценными инструментами в целенаправленном нарушении клеточной функции. Например, аналог блеббистатина, азидоблеббистатин, использовался для усиленного ингибирования миозина при освещении ^15,16. Это подчеркивает потенциал для новых открытий благодаря способности пространственно-временно контролируемого ингибирования клеточной функции.

Живые 3D-организмы представляют собой превосходные, но более тонкие системы для манипулирования динамикой микротрубочек на общеживийном, одноклеточном или субклеточном уровне в физиологических условиях. В частности, предимплантационный эмбрион мыши дает исключительное представление о внутренней работе клетки, а также о межклеточных отношениях внутри организма¹⁷. Временные и пространственно-целевые последовательные циклы активации и дезактивации PST способствовали характеристике межфазного моста, постцитокинетической структуры между клетками, как нецентросомального центра организации микротрубочек в предимплантационном эмбрионе мыши¹⁶. Аналогичная экспериментальная установка продемонстрировала участие растущих микротрубочек в уплотнении эмбриона мыши, чтобы обеспечить образование бластоцисты¹⁸. Кроме того, PST также использовались в целых эмбрионах рыбок данио для исследования миграции нейронных клеток путем ингибирования роста микротрубочек в подмножестве клеток в заднем мозге¹⁹.

Этот протокол описывает экспериментальную установку и использование PST-1P в предимплантационном эмбрионе мыши. Инструкции, представленные здесь, также могут служить руководством для применения PST для широкого спектра целей, таких как изучение сегрегации хромосом и деления клеток, незаконный оборот внутриклеточного груза, а также морфогенез и миграция клеток. Кроме того, такие исследования будут способствовать внедрению PST в органоидных системах, бластоидах и других моделях эмбрионов, таких как Caenorhabditis elegans и Xenopus laevis, а также потенциально расширят использование PST для технологий экстракорпорального оплодотворения.