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Inmunología y contagio

Isolamento delle cellule endoteliali polmonari primarie di topo

Published: November 10, 2021
doi:
10.3791/63253
, ,
1Department of Pediatrics, Division of Critical Care,UCSF Benioff Children’s Hospital, 2Department of Anesthesia and Perioperative Care,University of California, San Francisco

Summary

In questo articolo, le cellule endoteliali polmonari primarie sono state isolate e coltivate da topi neonatali.

Abstract

Le cellule endoteliali svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione del tono vascolare, dell’immunità, della coagulazione e della permeabilità. La disfunzione endoteliale si verifica in condizioni mediche tra cui diabete, aterosclerosi, sepsi e danno polmonare acuto. È necessario un metodo affidabile e riproducibile per isolare le cellule endoteliali pure dai topi per studiare il ruolo delle cellule endoteliali nella patogenesi di queste e altre condizioni. In questo protocollo, le cellule endoteliali microvascolari polmonari sono state preparate da cuccioli di topo neonatale di 5-7 giorni. I polmoni vengono raccolti, tritati e digeriti enzimaticamente con collagenasi I e le cellule rilasciate vengono coltivate durante la notte. Le cellule endoteliali vengono quindi selezionate utilizzando IgG anti-PECAM1 (CD-31) coniugate a sfere magnetiche e le cellule vengono nuovamente coltivate fino alla confluenza. Una selezione secondaria delle cellule si verifica quindi con IgG anti-ICAM2 (CD-102) coniugate a sfere magnetiche per aumentare la purezza delle cellule endoteliali e le cellule vengono nuovamente coltivate fino alla confluenza. L’intero processo richiede circa 7-10 giorni prima che le cellule possano essere utilizzate per la sperimentazione. Questo semplice protocollo produce cellule endoteliali altamente pure (purezza >92%) che possono essere immediatamente utilizzate per studi in vitro , compresi gli studi incentrati sulla produzione di citochine e chemochine endoteliali, interazioni leucocita-endoteliale, vie di coagulazione endoteliale e permeabilità endoteliale. Con molti knockout e linee di topi transgenici disponibili, questa procedura si presta anche a comprendere la funzione di geni specifici espressi dalle cellule endoteliali in risposte sane e patologiche a lesioni, infezioni e infiammazioni.

Introduction

L’interesse per lo studio dell’endotelio vascolare è cresciuto di recente, poiché la disfunzione delle cellule endoteliali microvascolari si verifica in molteplici malattie umane, come ictus, malattie cardiovascolari, diabete, danno polmonare acuto, sepsi e lesioni non infettive 1,2,3,4,5. Per definire la patogenesi di queste condizioni e comprendere i ruoli di geni specifici nelle risposte protettive e disregolate delle cellule endoteliali, vi è la necessità di metodi affidabili per isolare e coltivare cellule endoteliali microvascolari di elevata purezza dai topi. Mentre molti studi utilizzano cellule endoteliali umane come le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) o le cellule endoteliali microvascolari polmonari umane (HMVEC), ci sono molteplici ragioni per utilizzare le cellule endoteliali del topo per studiare la funzione e la disfunzione endoteliale. In primo luogo, vi è una notevole eterogeneità nelle risposte delle cellule endoteliali di diversi donatori umani, che porta alla variabilità dei risultati tra i singoli esperimenti 6,7,8. In secondo luogo, il silenziamento dei bersagli genici nelle linee cellulari umane primarie può anche portare a livelli di espressione proteica variabili 9,10. Al contrario, c’è una minima eterogeneità nelle risposte delle cellule endoteliali di topo11, supponendo che il background genetico sia lo stesso tra i gruppi di studio. Inoltre, un gran numero di cellule endoteliali di topo può essere preparato raggruppando i polmoni di diversi topi neonatali. Questi fattori consentono risultati più coerenti e riproducibili tra gli esperimenti. Infine, la disponibilità di topi knockout o transgenici prevede anche l’isolamento di tipi cellulari privi di proteine di interesse.

Le notevoli sfide legate all’isolamento di popolazioni sane e pure di cellule endoteliali polmonari di topo utilizzando i metodi pubblicati 12,13,14,15,16 hanno portato allo sviluppo di un metodo più affidabile e diretto per isolare cellule endoteliali microvascolari polmonari di topo di alta qualità. I vantaggi dell’attuale protocollo includono l’utilizzo di topi neonatali, che sono prontamente disponibili, limitando i costi di allevamento e alloggio. Inoltre, nella nostra esperienza, la vitalità delle cellule endoteliali di topi neonatali è sostanzialmente superiore rispetto alle cellule endoteliali preparate da topi adulti. Poiché i topi neonatali hanno un piccolo tessuto polmonare, le cellule endoteliali possono essere raccolte digerendo i polmoni asportati in collagenasi piuttosto che utilizzando l’instillazione tracheale di collagenasi, che è raccomandata per la raccolta da topi adulti16. Ciò riduce anche il tempo tra l’eutanasia dei topi e l’ottenimento delle loro cellule endoteliali nei terreni di coltura cellulare e nell’incubatore senza influire sulla purezza o sulla resa o sulla riproducibilità delle risposte endoteliali. Infine, le popolazioni cellulari pure sono state isolate senza citometria a flusso, che può danneggiare o portare a rese inferiori delle cellule endoteliali14,15,17.

L’attuale protocollo modificato porta costantemente a cellule endoteliali di elevata purezza e vitali in 7-10 giorni che possono essere utilizzate immediatamente per esperimenti in vitro . L’isolamento delle cellule direttamente dagli animali knockout riduce anche al minimo la manipolazione delle cellule prima della sperimentazione. Questi metodi potrebbero essere utilizzati per studiare il ruolo di varie proteine nella funzione endoteliale per scoprire bersagli terapeutici a base endoteliale per più malattie.

Protocol

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dall’Institutional Animal Care and Use Committee dell’Università della California di San Francisco. Per lo studio sono stati utilizzati cuccioli di topo neonatale maschi C57BL/6 (età 5-7 giorni). L’intero protocollo richiede 7-10 giorni (Figura 1). 1. Preparazione del mezzo cellulare endoteliale Preparare il terreno basale: Eagle Medium modificato di Dulbecco con 4.500 mg/L di glucosio e 4 mM di L-Glutammina (DMEM) integrato con il 20% (v/v) di siero fetale bovino inattivato dal calore, 100 U/100 μg/mL di penicillina/streptomicina e 25 mM di HEPES (vedi Tabella dei materiali). Filtro sterile con filtro da 22 μM. Conservare il terreno basale a 4 °C e utilizzarlo entro un mese dalla preparazione. Preparare il terreno completo: terreno basale integrato con 100 μg/ml di eparina, 100 μg/ml di integratore per la crescita delle cellule endoteliali, 1x aminoacidi non essenziali e 1 mM di piruvato di sodio (vedere Tabella dei materiali). Filtro sterile con filtro da 22 μM. Conservare a 4 °C e consumare entro un mese dalla preparazione. 2. Prerivestimento di perle magnetiche antiratto13 Produrre 50 ml di tampone per il lavaggio delle perle: soluzione tamponata con fosfato (PBS) integrata con albumina sierica bovina (BSA) allo 0,1% (p/v). Filtro sterile con filtro da 22 μM e conservare a 4 °C e utilizzare entro un mese dalla preparazione. Vortice le sfere magnetiche per alcuni secondi per risospendere le perle e pipettare 50 μL delle perle (2 x 107 perle) in due provette da microcentrifuga da 1,5 ml, una per CD-31 e una per CD-102 (vedere Tabella dei materiali). Aggiungere 1 mL di tampone per il lavaggio delle perline e mescolare bene.NOTA: Tutti i volumi citati sono stati utilizzati per isolare cellule endoteliali da 3-4 cuccioli di topo neonatale (5-7 giorni di età). CD-31 e CD-102 sono i marcatori di superficie delle cellule endoteliali utilizzati per la selezione delle immunosfere magnetiche. Posizionare i tubi su un separatore magnetico e rimuovere il surnatante con una pipetta Pasteur di vetro. Ripetere il lavaggio 3 volte con 1 mL di tampone per il lavaggio delle perline ogni volta. Risospendere le perle nel volume originale delle sfere, 50 μL, con tampone di lavaggio delle perline. Quindi aggiungere 5 μL (2,5 μg) di anticorpo (CD-31/CD-102) a ogni 50 μL di perline. Incubare la sospensione del cordone a rotazione delicata su un rotatore end-over-end per una notte a 4 °C o per 3 ore a temperatura ambiente. Ripetere il lavaggio 4 volte. Risospendere le immunosfere nel volume originale, 50 μL, con tampone di lavaggio delle sfere e conservare a 4 °C e utilizzare entro 1-2 settimane. 3. Isolamento e placcatura delle cellule polmonari Preparare la soluzione di collagenasi di tipo 1 il giorno dell’isolamento: aggiungere 25 mg di collagenasi di tipo 1 a 25 ml di HBSS (vedere Tabella dei materiali). Incubare a 37 °C per 1 ora con rotazione delicata e filtro sterile con filtro da 22 μM. Conservare la soluzione in caldo a 37 °C. Iniettare per via intramuscolare cuccioli di topo di 5-7 giorni con eparina (25 μL/topo, 1.000 U/ml) 10 minuti prima dell’eutanasia per ridurre al minimo l’attivazione delle cellule endoteliali e la formazione di coaguli14,15. Eutanasia il cucciolo di topo con decapitazione usando forbici affilate in conformità con le linee guida AVMA 2020 per l’eutanasia. Quindi, fissare il mouse su una scheda di dissezione con il lato ventrale verso l’alto. Spruzzare la carcassa con etanolo al 70%, quindi esporre la cavità toracica tagliando prima il diaframma e poi tagliando verso l’alto lungo tutte le pareti laterali del torace. Riflettendo la gabbia toracica espone quindi il cuore e i polmoni.NOTA: Utilizzare pinze e forbici più piccole per questo passaggio, date le piccole dimensioni dei topi neonatali, e assicurarsi di non perforare il cuore o i polmoni in quanto ciò comporterà una rimozione inadeguata del sangue dai polmoni. Collegare un ago da 25 G a una siringa da 10 ml e iniettare 5 ml di DMEM freddo nel ventricolo destro del cuore per rimuovere il sangue dai polmoni. I polmoni diventeranno bianchi. Rimuovere i polmoni dalla cavità toracica, un lobo alla volta, tagliando i lobi distali ai bronchi corrispondenti. Raggruppa tutti i lobi polmonari in un tubo conico da 50 mL preriempito con 20 mL di mezzo basale ghiacciato (dal punto 1.1). Ripetere i passaggi 3.2-3.7 con gli altri cuccioli di topo, raggruppando tutti i lobi polmonari nello stesso tubo conico da 50 ml. Agitare delicatamente il tubo a mano per 10-15 s per lavare eventuali globuli rossi in eccesso visivamente apprezzati sulla superficie dei polmoni.NOTA: Non è necessario rimuovere tutto il sangue dall’interno o intorno ai polmoni; Tuttavia, questo migliora la purezza. Qualsiasi ulteriore manipolazione dei tessuti deve essere eseguita in un cappuccio sterile. Utilizzare un filtro cellulare per rimuovere i polmoni dai mezzi e trasferire il tessuto in un piatto di coltura di tessuto sterile monouso di 100 mm di diametro e tritare con forbici sterilizzate. Trasferire il tessuto tritato nel tubo conico da 50 mL con 25 mL di soluzione di collagenasi preriscaldata (punto 3.1). Agitare delicatamente su un miscelatore rotante per 45 minuti a 37 °C.NOTA: La sovradigestione anche per 60 minuti può portare a rese inferiori. Collegare una siringa da 20 mL a una cannula smussata da 15 G (vedere Tabella dei materiali) e triturare la sospensione 10-15 volte per rompere il tessuto in una sospensione cellulare. Sii vigoroso, ma evita di schiumare troppo.NOTA: Non ci saranno più pezzi visibili del polmone e, invece, la sospensione sarà torbida al completamento di questo passaggio. Filtrare la sospensione attraverso un filtro cellulare da 70 μm in un tubo conico fresco da 50 ml. Inoltre, sciacquare il tubo conico utilizzato per la digestione e il filtro cellulare con altri 15 ml di mezzo basale. Centrifugare la sospensione cellulare a 400 x g per 8 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante con un pipet Pasteur di vetro e risospendere il pellet in 2 ml di mezzo completo. Trasferire in un matraccio T-75 e aggiungere 8 ml di coltura completa a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 . Il giorno seguente, lavare due volte i palloni con 10 ml di soluzione salina bilanciata di Hank senza calcio e magnesio (HBSS/CMF) (vedere Tabella dei materiali) e aggiungere 10 ml di terreno completo.NOTA: Dopo 2-3 giorni, la coltura sarà confluente al 90-95% e pronta per l’isolamento immunologico primario. 4. Isolamento primario delle immunosfere e coltura delle cellule endoteliali Lavare le cellule endoteliali aderenti due volte con 10 mL HBSS/CMF. Aggiungere 2 mL di soluzione di distacco di cellule senza tripsina (vedere Tabella dei materiali) e incubare a 37 °C per ~5 min. Assicurarsi che tutte le celle siano state sollevate dal pallone.NOTA: Al posto della tripsina è necessario utilizzare una soluzione di distacco priva di tripsina poiché la tripsina può interrompere il marcatore di adesione della superficie cellulare CD-31. Aggiungere 8 mL di mezzo basale per neutralizzare la soluzione di distacco della cellula e trasferire il contenuto in un tubo conico da 15 ml. Centrifugare a 400 x g per 4 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante con un pipet Pasteur di vetro e risospendere le cellule in 2 ml di mezzo basale. Trasferire la sospensione della cella da 2 mL in un tubo di polistirene a fondo rotondo da 5 mL (vedere Tabella dei materiali). Perle rivestite Vortex anti-CD-31 per alcuni secondi per risospendere le perle e aggiungere 30 μL di perline per ogni 2 ml di sospensione cellulare. Chiudere il coperchio. Incubare il tubo per 10 minuti a temperatura ambiente su un rotatore end-over-end. Quindi posizionare i tubi su un separatore magnetico e lasciare per 2 minuti. Utilizzando delicatamente una pipetta Pasteur di vetro, aspirare il surnatante. Rimuovere il tubo dal magnete, risospendere il pellet a lamelle aggiungendo 3 ml di mezzo basale al tubo e pipettare su e giù più volte. Riposizionare il tubo sul separatore magnetico per 2 minuti, quindi aspirare con cura il surnatante utilizzando una pipetta Pasteur in vetro. Ripetere i lavaggi (punto 4.6-4.7) almeno 4 volte fino a quando il surnatante appare chiaro. Dopo il lavaggio finale, risospendere il pellet a cellule a perline in 3 ml di terreno di crescita completo e trasferirlo in un matraccio T-75. Aggiungere 7 ml del terreno di coltura completo e incubare a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 . Il giorno successivo lavare le celle con HBSS/CMF, quindi aggiungere 10 ml di terreno completo fresco. Sostituire il terreno con 10 ml di terreno completo fresco ogni 2-3 giorni fino a quando il 90-95% è confluente.NOTA: Una volta che le cellule sono ~ 90-95% confluenti, che richiede ~ 3-4 giorni, la coltura è pronta per l’isolamento secondario immunobead. 5. Isolamento secondario delle immunosfere e coltura delle cellule endoteliali Lavare due volte le cellule endoteliali aderenti con 10 ml di HBSS/CMF. Aggiungere 2 mL di soluzione di distacco di cellule senza tripsina e incubare a 37 °C per ~5 min. Assicurarsi che tutte le celle siano state sollevate dal pallone. Aggiungere 8 mL di mezzo basale per neutralizzare la soluzione di distacco cellulare e trasferire in un tubo conico da 15 ml. Centrifugare a 400 x g per 4 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante con un pipet Pasteur di vetro e risospendere le cellule in 2 ml di mezzo basale. Trasferire la sospensione della cella da 2 mL in un tubo di polistirene a fondo rotondo da 5 ml. Perle rivestite Vortex anti-CD-102 per alcuni secondi per risospendere le perle e aggiungere 30 μL di perline per ogni 2 ml di sospensione cellulare. Chiudere il coperchio. Incubare il tubo per 10 minuti a temperatura ambiente su un rotatore end-over-end. Posizionare i tubi su un separatore magnetico e lasciare agire per 2 minuti. Quindi aspirare delicatamente il surnatante usando un pipet Pasteur di vetro. Rimuovere il tubo dal magnete, risospendere il pellet a lamelle aggiungendo 3 ml di mezzo basale al tubo e pipettare su e giù più volte. Riposizionare il tubo sul separatore magnetico per 2 minuti prima di aspirare accuratamente il surnatante utilizzando una pipetta Pasteur in vetro. Ripetere i lavaggi (punto 5.6-5.7) 4 volte o più fino a quando il surnatante appare chiaro. Dopo il lavaggio finale, risospendere il pellet a cellule a perline in 3 ml di terreno di crescita completo e trasferirlo in un matraccio T-75. Aggiungere 7 mL di terreno di coltura completo e incubare a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 . Il giorno successivo lavare le celle con HBSS/CMF, quindi aggiungere 10 ml di terreno completo fresco. Sostituire il terreno con 10 ml di terreno completo fresco ogni 2-3 giorni fino a quando il 90-95% è confluente. Una volta che le cellule endoteliali sono completamente confluenti, sono pronte per la sperimentazione. Le cellule non devono essere utilizzate oltre il passaggio sei poiché può verificarsi la senescenza e altri tipi di cellule possono prendere il sopravvento. 6. Conferma dei marcatori di superficie delle cellule endoteliali mediante citometria a flusso Dopo aver utilizzato la soluzione di distacco cellulare senza tripsina per staccare le cellule, risospendere il pellet cellulare a 1 x 10 5 cellule/ml e aliquote 100 μL della sospensione cellulare in tre provette da microcentrifuga da1,5 ml, marcate 1, 2 e 3. Lavare le celle con 1 mL di 1x PBS. Centrifugare a 500 x g per 2 minuti a 4 °C. Rimuovere il tampone di lavaggio e ripetere due volte. Risospendere il pellet cellulare in 100 μL di 1x PBS. Al tubo 1, aggiungere 1 μL di anticorpo coniugato anti-topo CD-31 (PECAM-1) (es: anticorpo anti-topo CD-31 anti-topo ficoeritrina (PE)) e 1 μL di anti-topo coniugato CD-102 (ICAM-2) (es: anticorpo CD102 anti-topo isotiocianato di fluoresceina (FITC)) (vedere Tabella dei materiali). Al tubo 2, aggiungere i controlli isotipo appropriati. Il tubo n. 3 rimarrà senza macchia. Incubare i tubi sul ghiaccio e al buio per 30-45 minuti. Aggiungere 1 mL di PBS a ciascuna provetta, vortice delicatamente e centrifugare a 500 x g per 2 minuti a 4 °C. Rimuovere il lavaggio e ripetere tre volte. Risospendere il pellet finale in 500 μL di PBS. Conservare i tubi coperti con un foglio di alluminio a 4 °C fino all’analisi. L’analisi deve essere completata entro 3-4 ore. Acquisire i dati di flusso utilizzando un citometro. Utilizzare un campione non colorato come controllo negativo per impostare correttamente la tensione laser in base all’autofluorescenza cellulare. Registra la popolazione totale delle celle con un grafico a dispersione sparsa in avanti e un grafico a dispersione laterale.NOTA: Dopo aver escluso i doppietti, le cellule CD31+ CD102+ doppie positive sono definite cellule endoteliali.

Representative Results

Questo semplice protocollo consente di isolare, coltivare e caratterizzare le cellule endoteliali microvascolari di topo nell’arco di 7-10 giorni (Figura 1). In breve, i polmoni vengono asportati e digeriti enzimaticamente prima della placcatura. Immediatamente dopo la placcatura, le cellule endoteliali e altre cellule galleggiano nei terreni di coltura cellulare. Entro il giorno seguente, le cellule endoteliali e le cellule contaminanti saranno fatte aderire alla piastra ed è necessaria una tecnica di lavaggio vigorosa per rimuovere i detriti e le cellule galleggianti. Una volta che le cellule raggiungono la confluenza, viene eseguita la prima selezione di immunosfere. Le cellule CD-31-positive iniziano quindi a crescere in una formazione di ciottoli (Figura 2). Le cellule che non hanno morfologia di ciottoli o crescono troppo sono contaminanti e non cellule endoteliali13,14,15,16. Una seconda selezione di immunosfere viene quindi eseguita utilizzando perle rivestite anti-CD-102 per aumentare la purezza delle cellule endoteliali, simile ad altri protocolli13,16. Le cellule che sono cresciute fino alla confluenza dopo la seconda selezione di immunosfere possono quindi essere utilizzate per la sperimentazione. La selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) viene utilizzata per confermare che la popolazione cellulare è CD-31- e CD-102-positiva (Figura 3). Queste cellule endoteliali possono quindi essere utilizzate per molte applicazioni, come lo studio delle vie infiammatorie endoteliali e della funzione di barriera endoteliale. Ad esempio, è stato osservato che il trattamento con citomix murino (IFNg, TNFa e IL1b, ciascuno a 10 ng / ml) ha indotto la produzione di IL-6 da parte delle cellule endoteliali (Figura 4A). Quindi è stato utilizzato Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS)18 per misurare la resistenza transendoteliale (TER) al flusso di corrente elettrica attraverso i monostrati di cellule endoteliali polmonari murine. È stato osservato che le cellule trattate con cytomix hanno portato ad una diminuzione della TER (Figura 4B), che è coerente con un aumento della permeabilità endoteliale. Questi esempi illustrano come le cellule endoteliali preparate utilizzando questo protocollo possono studiare vari processi endoteliali. Ciò consente ai ricercatori di studiare più facilmente i geni di interesse nelle cellule endoteliali, dato il numero sempre crescente di topi knockout e transgenici disponibili. Figura 1: Schema per l’isolamento delle cellule endoteliali polmonari murine. I polmoni dei cuccioli neonatali di 5-7 giorni vengono raccolti e tritati. Il tessuto tritato è stato digerito enzimaticamente con collagenasi I. La sospensione cellulare viene placcata e coltivata per 2-3 giorni. Le cellule vengono quindi sottoposte a isolamento primario di immunosfere con perline rivestite di CD-31 e vengono coltivate per altri 3-4 giorni. Secondo isolamento immunobead con perline rivestite di CD-102 prima di coltivare altri 2-3 giorni. Le cellule sono ora pronte per la sperimentazione funzionale. L’immagine è stata creata da uno strumento di illustrazione basato sul web, Biorender. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 2: Morfologia delle cellule endoteliali polmonari murine. Le cellule endoteliali polmonari murine coltivate mostrano una morfologia di ciottoli. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 3: Analisi delle cellule endoteliali mediante citometria a flusso. (A) Tutti gli eventi sono visualizzati su un dot plot del Forward Scatter (FSC) e del Side Scatter (SSC). (B) Conferma del grafico a dispersione che le cellule endoteliali polmonari murine sono positive per entrambi gli antigeni di superficie cellulare endoteliali specifici CD-31 e CD-102. (C) Istogramma del campione di isotipo e campione colorato con anticorpo specifico CD-31/CD-102. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 4: Cytomix induce la produzione di IL-6 delle cellule endoteliali polmonari murine e la permeabilità delle cellule endoteliali. Le cellule endoteliali microvascolari polmonari murine di topi C57BL/6 sono state trattate con cytomix (IFNg, TNFa e IL1b, ciascuna a 10 ng/ml). (A) I livelli di IL-6 sono stati poi quantificati in supernatanti di coltura a 15 h (**p<0,01, n = 4 pozzetti/condizione). (B) Il rilevamento dell’impedenza del substrato cellulare elettrico è stato utilizzato per misurare ripetutamente la resistenza transendoteliale (TER) nell’arco di 15 ore. I dati sono stati normalizzati alla resistenza immediatamente prima dell’aggiunta del citomix come designato e sono stati analizzati mediante analisi bidirezionale della varianza (ANOVA) seguita dal Tukey post-test19 (**p<0.01, n = 4 pozzetti/condizione). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussion

Questo semplice protocollo si presta a cellule endoteliali di elevata purezza provenienti da polmoni murini. Sebbene il tempo totale dall’inizio alla fine sia di 7-10 giorni, il tempo di intervento è di circa 3-4 ore. Rispetto ad altri metodi13,14,15,16, il protocollo attuale è semplificato, mantenendo i passaggi essenziali senza compromettere la resa e la purezza.

Vale la pena notare alcuni aspetti critici di questo protocollo. In primo luogo, è importante utilizzare cuccioli neonatali piuttosto che topi adulti. Nella nostra esperienza, le cellule endoteliali di topi adulti non proliferano facilmente come le cellule dei cuccioli neonatali e sono facilmente invase da cellule con morfologia simile a un fuso coerente con fibroblasti o cellule staminali mesenchimali15,16. Una possibile spiegazione per la differenza è che lo sviluppo polmonare è nella fase alveolare nei topi neonatali, caratterizzato dalla più rapida proliferazione delle cellule endoteliali20. Ci può anche essere un certo grado di senescenza con l’etàdi 21 anni. Anche il tempo di digestione enzimatica deve essere preciso, poiché la sottodigestione può portare a una sospensione unicellulare a basso rendimento. Al contrario, la digestione eccessiva può portare a una notevole quantità di morte cellulare. Abbiamo determinato che il tempo ottimale per la digestione della collagenasi è determinato in 45 minuti. Questo è poi seguito dalla dissociazione meccanica con una cannula smussata. Anche l’instillazione di collagenasi intratracheale durante la digestione enzimatica è stata riportata14,15; Tuttavia, questo può richiedere molto tempo e porta a una digestione incompleta durante il lavoro corrente. Infine, alcuni protocolli procedono direttamente all’isolamento immunobead immediatamente dopo la digestione enzimatica13,16. Abbiamo scoperto che la coltura delle cellule dal polmone dissociato nel mezzo per un giorno o due prima di effettuare la selezione delle immunosfere aumenta sostanzialmente la resa delle cellule endoteliali vitali e altamente pure. Ciò può essere correlato alla velocità di ottenere cellule isolate nel terreno di coltura tissutale, che porta a una minore morte cellulare nelle fasi iniziali dopo la rimozione dai topi, a una maggiore densità di semina iniziale e al tempo per le cellule endoteliali di aderire e proliferare prima del primo isolamento immunobead.

I limiti della preparazione e delle analisi delle cellule endoteliali di topo sono i seguenti. Ogni mouse fornisce solo un numero limitato di celle che devono essere utilizzate entro pochi passaggi. Questo problema può essere superato raggruppando il digest polmonare da diversi topi. Sfortunatamente, non abbiamo successo nei nostri sforzi per crioconservare e scongelare le cellule per un uso futuro. Nonostante queste limitazioni, le cellule endoteliali del topo hanno alcuni vantaggi. Possono essere utili, in particolare in situazioni in cui le cellule endoteliali umane non possono essere utilizzate (ad esempio, knockout genico), quando sono necessari studi complementari per corroborare i risultati con cellule umane o quando l’eterogeneità delle risposte delle cellule endoteliali di diversi donatori umani rende problematica la riproducibilità tra gli esperimenti6. La popolazione omogenea di cellule endoteliali di topi geneticamente identici consente la riproducibilità tra esperimenti e lo studio di geni e percorsi specifici in condizioni di fondo stabili.

Le cellule endoteliali di topo possono essere utilizzate per molteplici applicazioni per fornire informazioni sull’attivazione e la disfunzione endoteliale in diversi processi patologici. Ad esempio, le cellule endoteliali svolgono un ruolo fondamentale nella sepsi, contribuendo a risposte sia benefiche che patologiche attraverso i loro ruoli nell’attivazione dell’infiammazione localizzata e sistemica, promuovendo il traffico e l’attivazione dei leucociti nei tessuti, regolando la coagulazione e modulando la permeabilità endoteliale 2,22,23 . Questo semplice protocollo fornisce cellule endoteliali vitali e funzionali che possono essere utilizzate nei saggi per ciascuno di questi processi endoteliali.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da NIH T32GM008440 (JH/EW) e NIH R01AI058106 (JH). Riconosciamo l’UCSF Parnassus Flow Cytometry Core (RRID:SCR_018206) supportato in parte dal Grant NIH P30 DK063720 e dal NIH S10 Instrumentation Grant S10 1S10OD021822-01.

Materials

50 mL conicals Corning Life Sciences 430829
Accutase Cell Detachment Solution Innovative Cell Technologies, Inc AT-104
BD PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8" Becton Disckinson 305122
BioRender.com BioRender
Blunt Cannula 15 G x 1-1/2" Covidien 8881202314
CD-102 Rat anti-mouse (3C4 (MIC2/4)) BD Biosciences 553326
CD-31 Rat anti-mouse (MEC 13.3) BD Biosciences 557355
Collagenase, Type 1 Worthington Biochemical Corp LS004194
DMEM, high glucose Gibco 11965092
Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG Invitrogen 11035
Endothelial Cell Growth Supplment EMD Millipore Corp 02-102
Falcon cell strainers (70 µm) Corning Life Sciences 352350
Fetal Bovine Serum, heat inactivated Gibco 10082-147
Fine Scissors Fine Science Tools 14060-09
Fine Scissors Fine Science Tools 14060-10
Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20B
FITC Rat Anti-mouse CD102 (3C4) BD Biosciences 557444
FITC Rat IgG2a, κ Isotype Control (R35-95) BD Biosciences 553929
Graefe Forceps Fine Science Tools 11050-10
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco 14175095
Heparin Sodium Injections (1,000 Units/mL) Medline 0409-2720-02
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma H3393
HEPES (1 M) Gibco 15630106
Nonessential amino acids (100x) Gibco 11140050
PE Rat Anti-mouse CD31 (MEC 13.3) BD Biosciences 553373
PE Rat IgG2a,  κ Isotype Control R35-95) BD Biosciences 553930
Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL, 10,000 µg/mL) Gibco 15140122
Recombinant Murine IFN-γ Peprotech 315-05
Recombinant Murine IL-1β Peprotech 211-11B
Recombinant Murine TNF-α Peprotech 315-01A
Round bottom polystyrene test tubes Corning Life Sciences 352058
Semken Forceps Fine Science Tools 11008-13
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360070
Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System, 250 mL Millipore S2GPU02RE
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit Milipore SCGP00525
Sterile syringe (10 mL) Fisher Scientific 14-955-459
Sterile syringe (20 mL) Fisher Scientific 14-955-460
T-75 cell culture flask with vent cap, CellBIND treated Corning Life Sciences 3290
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Referencias

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Wong, E., Nguyen, N., Hellman, J. Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (177), e63253, doi:10.3791/63253 (2021).
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