小鼠原代肺内皮细胞的分离

所有动物程序均由加州大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会批准。雄性C57BL / 6新生小鼠幼崽（年龄5-7天）用于研究。整个协议需要7-10天（图1）。 1. 内皮细胞培养基的制备 准备基础培养基：Dulbecco 的改良鹰培养基含有 4，500 mg/L 葡萄糖和 4 mM L-谷氨酰胺 （DMEM），补充有 20% （v/v） 热灭活胎牛血清、100 U/100 μg/mL 青霉素/链霉素和 25 mM HEPES（见 材料表）。带22μM过滤器的无菌过滤器。将基础培养基储存在4°C，并在制备后一个月内使用。 准备完整的培养基：基础培养基补充有100μg/ mL肝素，100μg/ mL内皮细胞生长补充剂，1x非必需氨基酸和1mM丙酮酸钠（见 材料表）。带22μM过滤器的无菌过滤器。储存在4°C并在制备后一个月内使用。 2. 抗鼠磁珠的预涂13 制作 50 mL 珠洗缓冲液：补充有 0.1% （w/v） 牛血清白蛋白 （BSA） 的磷酸盐缓冲溶液 （PBS）。无菌过滤器与22μM过滤器并储存在4°C并在制备后一个月内使用。 将磁珠涡旋几秒钟以重悬磁珠，并将 50 μL 磁珠（2 x 107 个磁珠）移液到两个 1.5 mL 微量离心管中，一个用于 CD-31，一个用于 CD-102（参见 材料表）。加入 1 mL 珠洗缓冲液并充分混合。注意：所有提到的体积都用于从3-4只新生小鼠幼崽（5-7天大）中分离内皮细胞。CD-31和CD-102是用于磁性免疫珠选择的内皮细胞表面标志物。 将试管放在磁选机上，并用玻璃巴斯德移液管除去上清液。每次用 1 mL 珠洗缓冲液重复洗涤 3 次。 用磁珠洗涤缓冲液将磁珠重悬于原始微球体积 50 μL。然后向每 50 μL 磁珠中添加 5 μL （2.5 μg） 抗体 （CD-31/CD-102）。 将珠悬浮液在4°C下在端对端旋转器上轻轻旋转过夜或在室温下孵育3小时。重复洗涤4次。 用磁珠洗涤缓冲液将免疫珠重悬于原始体积50μL中，并储存在4°C并在1-2周内使用。 3. 肺细胞的分离和电镀 在分离当天准备1型胶原酶溶液：将25mg的1型胶原酶加入25mL的HBSS中（见 材料表）。在37°C下温育1小时，轻轻旋转并使用22μM过滤器无菌过滤器。将溶液保温至37°C。 在安乐死前 10 分钟肌内注射 5-7 天大的小鼠幼崽肝素（25 μL/小鼠，1，000 U/mL），以尽量减少内皮细胞活化和凝块形成14，15。 根据 2020 年 AVMA 安乐死指南，使用锋利的剪刀对小鼠幼崽实施斩首安乐死。然后，将鼠标固定在腹侧朝上的解剖板上。 用70%乙醇喷洒胴体，然后首先切割横膈膜，然后沿着胸部的整个侧壁向上切割，从而暴露胸腔。反射肋骨，然后暴露心脏和肺部。注意：鉴于新生小鼠的体型较小，在此步骤中使用较小的镊子和剪刀，并确保不要刺穿心脏或肺部，因为这会导致肺部血液排出不足。 将 25 G 针头连接到 10 mL 注射器上，并将 5 mL 冷 DMEM 注入心脏右心室以去除肺部血液。肺部会变白。 通过切开相应支气管远端的肺叶，一次一个肺叶从胸腔中取出肺。 将所有肺叶汇集到预装有 20 mL 冰冷基础培养基的 50 mL 锥形管中（来自步骤 1.1）。 与其他小鼠幼崽重复步骤3.2-3.7，将所有肺叶汇集到相同的50 mL锥形管中。 用手轻轻搅拌管子10-15秒，以清洗肺部表面任何多余的红细胞。注意：没有必要从肺部内部或周围清除所有血液;但是，这提高了纯度。任何进一步的组织处理都需要在无菌罩中进行。 使用细胞过滤器从培养基中取出肺，并将组织转移到无菌的一次性100 mm直径组织培养皿中，并用无菌剪刀切碎。 将切碎的组织转移到装有25 mL预热胶原酶溶液的50 mL锥形管中（步骤3.1）。在37°C下在旋转混合器上轻轻搅拌45分钟。注意：即使过度消化 60 分钟也会导致产量降低。 将20mL注射器连接到15G钝性插管（参见 材料表）并将悬浮液研磨10-15次，以将组织分解为细胞悬浮液。要有活力，但要避免过度起泡。注意：将不再有可见的肺部分，取而代之的是，完成此步骤后，悬浮液将变得混浊。 通过 70 μm 细胞过滤器将悬浮液过滤到新鲜的 50 mL 锥形管中。此外，用额外的 15 mL 基础培养基冲洗用于消化的锥形管和细胞过滤器。 在4°C下以400× g 离心细胞悬液8分钟。 用玻璃巴斯德移液管除去上清液，并将沉淀重悬于2mL完全培养基中。转移到T-75烧瓶中，并在37°C的加湿，5%CO2 培养箱中加入8mL完全培养基。 第二天，用10 mL不含钙和镁的Hank平衡盐溶液（HBSS/CMF）（参见 材料表）洗涤烧瓶两次，并加入10 mL完全培养基。注意：2-3天后，培养物将融合90-95%，并准备进行原代免疫珠分离。 4. 原代免疫珠分离和内皮细胞培养 用 10 mL HBS/CMF 洗涤贴壁内皮细胞两次。加入2mL无胰蛋白酶细胞分离溶液（参见 材料表），并在37°C下孵育~5分钟。确保所有细胞都已从烧瓶中取出。注意：需要使用无胰蛋白酶分离溶液代替胰蛋白酶，因为胰蛋白酶会破坏细胞表面粘附标志物CD-31。 加入 8 mL 基础培养基以中和细胞分离溶液并将内容物转移到 15 mL 锥形管中。在室温下以400× g 旋转4分钟。 使用玻璃巴斯德移液管除去上清液，并将细胞重悬于2 mL基础培养基中。将 2 mL 细胞悬液转移到 5 mL 圆底聚苯乙烯管中（参见 材料表）。 涡旋抗 CD-31 包被的磁珠几秒钟以重悬磁珠，每 2 mL 细胞悬液添加 30 μL 磁珠。盖上盖子。 在室温下在端对端旋转器上孵育管10分钟。然后将试管放在磁选机上并放置2分钟。 轻轻地使用玻璃巴斯德移液管，吸出上清液。从磁体上取下试管，通过向试管中加入 3 mL 基础培养基来重悬磁珠细胞沉淀，并上下移液数次。 更换磁选机上的管2分钟，然后使用玻璃巴斯德移液管小心地吸出上清液。 重复洗涤（步骤4.6-4.7）至少4次，直到上清液看起来澄清。 最后一次洗涤后，将磁珠细胞沉淀重悬于3 mL完全生长培养基中，并将其转移到T-75烧瓶中。加入7mL完全生长培养基，并在37°C下在加湿的5%CO2 培养箱中孵育。 第二天用HBSS/CMF洗涤细胞，然后加入10mL新鲜完全培养基。每 2-3 天用 10 mL 新鲜完全培养基替换培养基，直至 90-95% 汇合。注意：一旦细胞~90-95%汇合，这需要~3-4天，培养物就可以进行二次免疫珠分离。 5. 免疫珠二次分离和内皮细胞培养 用 10 mL HBSS/CMF 洗涤贴壁内皮细胞两次。加入2mL无胰蛋白酶细胞分离溶液，并在37°C下孵育~5分钟。确保所有细胞都已从烧瓶中取出。 加入 8 mL 基础培养基以中和细胞分离溶液，并转移到 15 mL 锥形管中。在室温下以400× g 旋转4分钟。 使用玻璃巴斯德移液管除去上清液，并将细胞重悬于2mL基础培养基中。将 2 mL 细胞悬液转移到 5 mL 圆底聚苯乙烯管中。 涡旋抗 CD-102 包被磁珠几秒钟以重悬磁珠，每 2 mL 细胞悬液添加 30 μL 磁珠。盖上盖子。 将管在室温下在端对端旋转器上孵育10分钟。将试管放在磁选机上，静置2分钟。然后使用玻璃巴斯德移液管轻轻吸出上清液。 从磁体上取下试管，通过向试管中加入 3 mL 基础培养基来重悬磁珠细胞沉淀，并上下移液数次。 更换磁选机上的管2分钟，然后使用玻璃巴斯德移液管小心地吸出上清液。 重复洗涤（步骤5.6-5.7）4次或更多次，直到上清液出现澄清。 最后一次洗涤后，将磁珠细胞沉淀重悬于3 mL完全生长培养基中，并将其转移到T-75烧瓶中。加入7mL完全生长培养基，并在37°C下在加湿的5%CO2 培养箱中孵育。 第二天用HBSS/CMF洗涤细胞，然后加入10mL新鲜完全培养基。每 2-3 天用 10 mL 新鲜完全培养基替换培养基，直至 90-95% 汇合。一旦内皮细胞完全融合，它们就可以进行实验了。细胞不应在第六代后使用，因为可能发生衰老，并且其他细胞类型可能会接管。 6.流式细胞术确认内皮细胞表面标志物 使用无胰蛋白酶细胞分离溶液分离细胞后，将细胞沉淀重悬至 1 x 10 5 个细胞/mL，并将 100 μL 细胞悬液等分到三个1.5 mL 微量离心管中，标记为 1、2 和 3。 用 1 mL 的 1x PBS 洗涤细胞。在4°C下以500× g 离心2分钟。 取出洗涤缓冲液并重复两次。 将细胞沉淀重悬于 100 μL 1x PBS 中。向试管 1 中加入 1 μL 偶联抗小鼠 CD-31 （PECAM-1） 抗体（例如：藻红蛋白 （PE） 抗小鼠 CD-31 抗体）和 1 μL 偶联抗小鼠 CD-102 （ICAM-2）（例如：异硫氰酸荧光素 （FITC） 抗小鼠 CD102 抗体）（参见 材料表）。对于管2，添加适当的同种型对照。3号管将保持未染色。 将试管在冰上和黑暗中孵育30-45分钟。 向每个管中加入1mL PBS，轻轻涡旋，并在4°C下以500× g 离心2分钟。 取出洗净液，重复三次。将最终沉淀重悬于 500 μL PBS 中。 将管子用铝箔覆盖在4°C直至分析。分析需要在3-4小时内完成。 使用流式细胞仪采集流数据。使用未染色的样品作为阴性对照，根据细胞自发荧光正确设置激光电压。使用前向散射图和侧散点图门禁总细胞群。注意：排除双峰后，CD31 + CD102 +双阳性细胞定义为内皮细胞。