Análisis de la dinámica de la actina, el acoplamiento del embrague y la fuerza de tracción para el avance del cono de crecimiento

Todos los experimentos con animales de laboratorio se realizaron con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Ciencia y Tecnología de Nara. Los investigadores deben seguir las directrices establecidas por sus comités reguladores de animales institucionales y nacionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio. 1. Preparación de soluciones y medios Preparar las soluciones y los medios de cultivo como se resume en el Archivo Suplementario 1 2. Preparación de sustratos recubiertos de poli-D-lisina (PDL)/laminina Cubra los platos con fondo de vidrio de 14 mm de diámetro con 100 μg/ml de PDL, disueltos en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7.4), e incube durante la noche en una incubadora humidificada a 37 °C.NOTA: No seque las superficies de vidrio después de este paso Retire la solución PDL y pipetee 1 ml de PBS en el vidrio durante 10 s tres veces. Cubra los platos con 5 μg/ml de laminina, disuelto en PBS, e incube durante la noche en una incubadora humidificada a 37 °C. Retire la solución de laminina y pipete 1 ml de PBS en el vidrio durante 10 s tres veces. Retire el PBS y coloque 0,5 ml del medio neurobasal sobre las superficies de vidrio. Guarde los platos en una incubadora humidificada a 37 °C.NOTA: Los platos recubiertos de PDL/laminina se pueden almacenar durante 2-3 días en una incubadora humidificada a 37 °C. 3. Disección y disociación del hipocampo Eutanasia a una ratón embarazada por luxación cervical.NOTA: El presente estudio utiliza ratones disponibles comercialmente (ver Tabla de Materiales). Los investigadores deben usar ratones que sean criados y tratados humanamente en un ambiente esterilizado. Diseccionar embrionarios de ratón del día 16 (E16) y colocarlos en hielo. En una campana de flujo laminar, diseccione los cerebros con tijeras y colóquelos en un plato estéril de 10 cm que contenga 10 ml de solución de disección helada. Con un microscopio estereoscópico de disección, despegue cuidadosamente las meninges de los hemisferios cerebrales y luego diseccione los hipocampos con fórceps. Transfiera el hipocampo a 5 ml de solución de digestión helada en un tubo de 15 ml. Incubar el hipocampo en un baño de agua durante 20 min a 37 °C. Retire la solución de digestión y agregue 3 ml de solución de disección. Pipetee suavemente el hipocampo cuatro veces con una pipeta Pasteur. Incubar el hipocampo en un baño de agua durante 20 min a 37 °C. Transfiera la suspensión celular a un tubo centrífugo de 50 ml. Añadir 3 ml de nueva solución de disección al tejido no disociado. Repita los pasos 3.7-3.9 hasta que el hipocampo esté completamente disociado. Elimine los agregados flotantes de ADN de la suspensión celular girando y aspirando con una pipeta Pasteur. Centrifugar la suspensión celular a 180 x g durante 20 min a 4 °C.NOTA: El ADN derivado de células dañadas perturbará el proceso de centrifugación. Si las neuronas permanecen en el sobrenadante, centrífuga la suspensión celular nuevamente después de eliminar cuidadosamente el ADN. Medio neurobasal equilibrante que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS), penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 μg/mL) en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2. 4. Transfección y cultivo de neuronas Retire el sobrenadante y agregue 5 ml de PBS helado en el tubo de 50 ml. Resuspend el pellet celular mediante pipeteo suave. Transfiera 10 μL de la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga, agregue 10 μL de solución de azul de tripano al 0,5% y luego cuente el número de células con un hemocitómetro. Centrifugar la suspensión celular en el tubo de 50 ml a 180 x g durante 20 min a 4 °C. Mientras tanto, la alícuota para la transfección, 1 μg de pFN21A-HaloTag-actina y 3 μg de pmNeonGreen-N1-Lifeact por 1 x 106 células, en un tubo de microcentrífuga. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y agregue 100 μL de medio de electroporación (proporcionado por el kit de transfección) en el tubo de 50 ml. Resuspendir el pellet celular mediante pipeteo. Mezcle la suspensión celular con la solución de ADN alicitada y transfiera la mezcla a una cubeta (proporcionada por el kit de transfección).NOTA: Dado que las burbujas de aire perturban la electroporación, retírelas de la suspensión de la celda. Inserte la cubeta en el aparato de electroporación (Tabla de Materiales) y realice la electroporación utilizando el programa O-005. Agregue inmediatamente 1 ml del medio neurobasal precalentado y equilibrado que contiene 10% de FBS, penicilina (100 U / ml) y estreptomicina (100 μg / ml) a la cubeta. Transfiera la suspensión celular a un tubo centrífugo de 15 ml utilizando una pipeta de plástico (proporcionada por el kit de transfección). Transfiera 10 μL de la suspensión celular a un microtubo, agregue 10 μL de solución de azul de tripano al 0,5% y luego cuente el número de células con un hemocitómetro. Saque los platos con fondo de vidrio recubiertos de PDL / laminina de la incubadora y retire el medio neurobasal. Pipetear 0,5 mL de la suspensión celular que contiene 2,0 x 105 células por plato e incubar en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2 durante 3 h. Reemplace el medio con 0.5 ml de medio neurobasal que contenga un suplemento de B-27 al 2%, glutamina (1 mM), penicilina (100 U / ml) y estreptomicina (100 μg / ml). Cultiva las neuronas en una incubadora humidificada durante 3 días a 37 °C con un 5% de CO2. 5. Imágenes de una sola mota en los conos de crecimiento neuronal El día in vitro (DIV) 3, tratar las neuronas con ligando tetrametil-rodamina (TMR) a una dilución de dilución 1:2000 en medio de cultivo. Mantener las neuronas durante 1 h a 37 °C con un 5% de CO2. Lave el ligando TMR tres veces con PBS precalentado. Retire el PBS y pipetee 0.5 ml del medio L-15 de Leibovitz calentado que contiene un suplemento de B-27 al 2%, glutamina (1 mM), penicilina (100 U / ml) y estreptomicina (100 μg / ml). Mantener las neuronas durante 1 h a 37 °C. Encienda un microscopio de epifluorescencia y ajuste la incubadora de la parte superior del escenario a 37 °C.NOTA: El presente protocolo utiliza un microscopio de epifluorescencia equipado con una cámara semiconductora complementaria de óxido metálico, una lente de objetivo de inmersión en aceite de 100x/1.40 NA, una lámpara de mercurio y un software de adquisición de imágenes (ver Tabla de Materiales). Para este análisis también se pueden utilizar otros microscopios de epifluorescencia con especificaciones equivalentes. Coloque las neuronas tratadas con ligando TMR en el plato con fondo de vidrio en la incubadora de la parte superior de la etapa calentada. Establezca los parámetros de adquisición de imágenes de la siguiente manera: tiempo de exposición, 500 ms para los canales fluorescentes Lifeact y HaloTag-actina; binning, 1 x 1 (0,065 μm × 0,065 μm por píxel); intervalo de tiempo, 3 s; duración, 50 fotogramas. Seleccione un cono de crecimiento que exprese fuertemente Lifeact y exprese débilmente HaloTag-actina.NOTA: La expresión de Lifeact debe ser lo suficientemente fuerte como para visualizar la morfología del cono de crecimiento. La expresión de HaloTag-actina debe ser débil e insuficiente para ser detectada (Figura 2A). Los niveles de expresión de proteínas fluorescentes se pueden ajustar variando la cantidad de ADN para la transfección. Cierre el campo del diafragma para iluminar un área mínima que incluya el cono de crecimiento (Figura 2B).NOTA: La iluminación de un área mínima reduce la señal de fondo y aumenta la relación señal de fluorescencia a ruido (S / N), lo que permite la detección de manchas de actina (Figura 2B). Para aumentar aún más la relación S / N, se recomienda iluminar el cono de crecimiento sin reducir la luz mediante filtros de densidad neutra. Adquirir imágenes de lapso de tiempo (Archivo suplementario 2). Guardar como una imagen de pila de lapso de tiempo multicanal (formato tiff). 6. Cuantificaciones de la velocidad de flujo de F-actina y la tasa de polimerización utilizando un software de procesamiento y análisis de imágenes Fiji NOTA: Consulte el Archivo Suplementario 3 para obtener datos de práctica para cuantificar la velocidad del flujo de F-actina y la tasa de polimerización de actina. Abra la imagen de la pila de lapso de tiempo multicanal en Fiji. Seleccione Analizar > Establecer escala y establezca el tamaño de píxel de las imágenes. Encuentre una mota de actina que fluya retrógradamente durante un mínimo de cinco marcos de tiempo dentro de un haz de F-actina en filopodia o lamellipodia. Seleccione Imagen > Transformar > Rotar y ajuste el ángulo de las imágenes para que el haz de F-actina apunte hacia arriba (Figura 3A). Haga clic en Rectángulo en la barra de herramientas y dibuje un cuadro que incluya manchas de actina y la punta del paquete de actina F (Figura 3B, 1 y 2).NOTA: Las señales de las manchas de halotag-actina son débiles. Además, las señales de Lifeact en las puntas distales del cono de crecimiento son débiles y débiles (Figura 2B) porque las puntas distales del cono de crecimiento son delgadas en comparación con la parte proximal. Los investigadores deben mejorar las señales para optimizar las cuantificaciones de la velocidad del flujo de F-actina y la tasa de polimerización (Figura 3B). Aunque la señal de Lifeact en el cono de crecimiento proximal se satura, esto no perturbará la determinación del extremo distal de las F-actinas (Figura 3E, línea amarilla). Seleccione Imagen > Duplicar e introduzca los cinco marcos de tiempo (Figura 3B, 3-5). Seleccione Image > Stacks > Make Montage e introduzca los parámetros: Columns, 5; Filas, 1; Factor de escala, 1. Haga clic en Aceptar. El montaje de la imagen aparecerá en la pantalla. Seleccione Imagen > color > Dividir canales. Esto separa los dos canales fluorescentes. Cuantificación de la velocidad de flujo de F-actina. Seleccione Analizar > Establecer medidas y elija Área y rectángulo delimitador. Haga clic en Óvalo en la barra de herramientas y dibuje un círculo en una mancha de actina (Figura 3C, 1 y 2). Seleccione Imagen > superposición > Agregar selección. El círculo se superpone en el montaje de la imagen (Figura 3C, 3 y 4).NOTA: El color de la superposición se puede cambiar en Editar > Opciones > Colores. Repita la superposición de círculos para las manchas restantes (Figura 3C, 5).NOTA: Para determinar con precisión los centros de las motas de actina, los investigadores deben superponer círculos en las manchas. Haga clic en Recto en la barra de herramientas y dibuje una línea que vincule los centros de los círculos (Figura 3D, 1 y 2). Seleccione Analizar > medir. El resultado aparecerá en la pantalla (Figura 3D, 3).NOTA: La altura mostrada en el resultado indica la distancia de translocación de la mancha de actina durante la observación (Figura 3D, 3). Calcule la velocidad del flujo de F-actina dividiendo la distancia de translocación por el tiempo de observación. Cuantificación de la tasa de polimerización de F-actina. Dibuje una línea que vincule las puntas del fibrado de F-actina (Figura 3E, 1). Seleccione Analizar > medir. El resultado aparecerá en la pantalla (Figura 3E, 2).NOTA: La altura en el resultado indica la longitud de extensión del haz de F-actina durante la observación (Figura 3E, 2). Calcule la tasa de extensión de F-actina dividiendo la longitud de la extensión por el tiempo de observación. Calcule la tasa de polimerización de F-actina como la suma de la velocidad de flujo de F-actina y la tasa de extensión (Figura 3F). 7. Preparación de un gel PAA para microscopía de fuerza de tracción y cultivos de neuronas Preparación de geles PAA necesarios para la microscopía de fuerza de tracción (Figura 4) Pipete 0,5 ml de NaOH (100 mM), disuelto en H2O destilado, en platos con fondo de vidrio de 27 mm de diámetro, e incube durante 15 min a temperatura ambiente (RT). Agregue 50 μL de 3-aminopropiltrimetoxisilano (APTMS) en la solución de NaOH en los platos y mezcle las soluciones mediante pipeteo suave, e incube durante 15 min en RT. Lave los platos con fondo de vidrio con H2O destilado y séquelos. Pipetear 0,5 ml de solución de glutaraldehído al 0,5%, disuelto en PBS, en el plato con fondo de vidrio tratado con APTMS, e incubar durante 30 min a RT. Lavar los platos con fondo de vidrio con H2O destilado y secar. Preparar una solución que contenga H2O destilado (412 μL), solución de acrilamida al 30% (p/v) (63 μL), solución de bisacrilamida al 2,5% (p/v) (6 μL) y solución de microesfera modificada con carboxilato (perla fluorescente) (20 μL).NOTA: Vórtice la solución de perla fluorescente para disociar las perlas agregadas antes de agregarlas a la solución de acrilamida. Desgasifica la solución en una cámara de vacío durante 30 min a RT. A esta solución, agregue 1 μL de persulfato de amonio (APS) al 10% (p/v), disuelto en H2O destilado, y 1 μL de N,N,N’,N’-tetrametilendiamina (TEMED), y mezcle mediante pipeteo suave. Coloque una cubierta de vidrio (18 mm de diámetro) en la tapa de un tubo centrífugo de 15 ml. Agregue inmediatamente 25 μL de la solución a la cubierta y luego coloque suavemente un plato con fondo de vidrio invertido en el estuche. Deje que la acrilamida polimerice durante 1 h en RT. Aplique H2O destilado en la funda y quítelo del gel con una aguja de jeringa con la punta doblada. Retire el H2O y agregue sulfo-SANPAH (1 mM), disuelto en PBS, al gel. En condiciones estériles, exponga los geles a la luz ultravioleta durante 5 min. Lave el gel tres veces con PBS durante 15 minutos por lavado. Determinación de la rigidez del gel con un método de indentación de microesferas (Figura 5A)44. Transfiera una microesfera que se especifica para el diámetro y la densidad, al gel y luego colóquela en la etapa de muestra de un microscopio confocal de escaneo láser. Concéntrese en la superficie del gel y registre la posición z (Figura 5B). Del mismo modo, concéntrese en la parte inferior de la microesfera y registre la posición z (Figura 5C). Calcule la profundidad de la hendidura determinada por la diferencia entre las posiciones z de la superficie del gel y el fondo de la microesfera. Calcule el módulo E de Young del gel mediante:donde f es el peso corregido de flotabilidad de la microesfera, d es la profundidad de indentación del gel, r es el radio de la microesfera y v es la relación de Poisson (cuyo valor es 0,3, como se determinó anteriormente46). Cubra los geles con PDL y laminina como se describe en la sección 2. Como se describe en las secciones 3 y 4, diseccionar embriones de ratón E16, disociar hipocampos y transfectar con 5 μg de pEGFP-C1 por 1,0 x 106 células. Semilla 2.0 x 105 células en geles recubiertos de PDL/laminina.NOTA: Para el análisis de la fuerza de tracción, las imágenes microscópicas de las células marcadas fluorescentemente son necesarias para determinar el área del cono de crecimiento. 8. Microscopía de fuerza de tracción en conos de crecimiento neuronal En DIV3, reemplace el medio de cultivo con 0.5 ml de medio L-15 calentado de Leibovitz que contiene un suplemento de B-27 al 2%, glutamina (1 mM), penicilina (100 U / ml) y estreptomicina (100 μg / ml). Mantener las neuronas durante 1 h a 37 °C. Encienda un microscopio confocal de barrido láser y ajuste la incubadora de la parte superior del escenario a 37 ° C.NOTA: El presente estudio utiliza un microscopio confocal de barrido láser equipado con una lente de objetivo de inmersión en agua 63x/1.2 NA y un software de adquisición y análisis de imágenes (ver Tabla de Materiales). Coloque las neuronas en el plato con fondo de vidrio en la incubadora de la parte superior del escenario precalentada. Establezca los parámetros de adquisición de imágenes de la siguiente manera: tamaño de escaneo, 512 × 512 píxeles; área de escaneo, zoom de 1.5-3x; velocidad de escaneo, ~1 s por fotograma; longitud de onda del láser, 561 nm (la longitud de onda de excitación para las perlas fluorescentes) y 488 nm (la longitud de onda de excitación para la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP)); intervalo de tiempo, 3 s; duración, 50 fotogramas. Para visualizar la morfología del cono de crecimiento, seleccione un cono de crecimiento que exprese fuertemente EGFP. Concéntrese en la superficie del gel y adquiera imágenes de lapso de tiempo (Figura 6A y Archivo suplementario 4).NOTA: Para el análisis de tracción, utilice dos canales fluorescentes (para perlas fluorescentes y EGFP) y un canal de campo brillante (se recomienda capturar imágenes de contraste de interferencia diferencial (DIC) o de contraste de fase). Utilice un software de procesamiento de imágenes (por ejemplo, Fiji) para producir pilas de imágenes RGB de lapso de tiempo de un solo canal y guarde estas imágenes como archivos tiff.NOTA: Es fundamental que los investigadores también guarden los datos sin procesar. Aplique 100 μL de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 10% (p/v), disuelto en H2O destilado, al plato con fondo de vidrio para relajar el sustrato del gel liberando neuronas del sustrato. Incubar el plato durante 5 min a 37°C para estabilizar la temperatura.NOTA: La imagen de las perlas en un sustrato no tensado se utiliza para hacer referencia a las posiciones originales de las perlas durante el análisis de la fuerza de tracción (Figura 6C). La aplicación de la solución SDS altera las posiciones xyz debido al cambio térmico en la incubadora y la relajación de la deformación inducida por la célula. Los investigadores, por lo tanto, necesitan corregir el plano focal y la posición x-y. Concéntrese en la superficie del gel y adquiera una imagen de las perlas en el sustrato sin tensión (Figura 6B). Produzca una imagen RGB de un solo canal de las perlas en el sustrato sin restricciones y guarde esta imagen como un archivo tiff. Corrección de la posición x-y de la imagen de la cuenta en el sustrato no tensado utilizando Fiji En Fiji, abra la imagen de la cuenta en el sustrato sin restricciones y la imagen de la pila de lapso de tiempo de las cuentas fluorescentes. Seleccione Pilas de > de imágenes > Herramientas > Concatenar. Aparecerá un cuadro de diálogo en la pantalla (Figura 7A, 1). Seleccione la imagen de perla en el sustrato sin tensión y la imagen de pila de lapso de tiempo de cuentas fluorescentes en Image1 e Image2, respectivamente (Figura 7A, 2). Haga clic en Aceptar. La imagen de perla en el sustrato no entrenado se agrega a la imagen de pila de lapso de tiempo (Figura 7A, 3). Usando la barra de desplazamiento (Figura 7B, 1, marco rojo), muestre el segundo marco de la imagen de la pila (flecha roja). Seleccione Plugins > StackReg (Figura 7B, 2). Aparecerá un cuadro de diálogo en la pantalla (Figura 7B, 3). Seleccione Cuerpo rígido en la lista desplegable (Figura 7B, 3, marco rojo) y haga clic en Aceptar. La corrección de la posición x-y comienza entonces. Utilice la barra de desplazamiento para mostrar el primer fotograma de la imagen de pila corregida por posición x-y. Seleccione Imagen > Duplicar (Figura 7C, 1). Aparecerá un cuadro de diálogo en la pantalla (Figura 7B, 2). Introduzca 1 en el rango, anule la selección de Duplicar pila (figura 7C, 2) y haga clic en Aceptar. La imagen de perla corregida por la posición x-y en el sustrato sin tensión aparecerá en la pantalla (Figura 7C, 3). Guarde esta imagen como un archivo tiff. Cuantificación de la fuerza de tracciónNOTA: El método descrito aquí para el análisis de la fuerza de tracción utiliza MATLAB y dos cajas de herramientas de MATLAB, ‘Image Processing Toolbox’ y ‘Parallel Computing Toolbox’. Los investigadores deberán instalarlos antes del análisis. El código de análisis de la fuerza de tracción se desarrolló en base a la versión 2018a de MATLAB. Por lo tanto, se debe utilizar la versión 2018a (o posterior) de MATLAB para el análisis. Los algoritmos utilizados para el análisis de la fuerza de tracción fueron descritos anteriormente22. Descargue el código de análisis de fuerza de tracción TFM2021 del Archivo Suplementario 5. Abrir TFM 2021 en MATLAB Abra main.m en TFM2021 y ejecútelo. Aparecerá una interfaz gráfica de usuario (GUI) en la pantalla (Figura 8A). Haga clic en Cargar imagen de sustrato sin tensión y seleccione la imagen de cuenta de posición corregida x-y en sustrato sin forzar. Haga clic en Cargar imágenes de cuentas fluorescentes y seleccione la imagen de pila de lapso de tiempo de cuentas. Haga clic en Cargar imágenes de campo brillante y seleccione la imagen de pila de lapso de tiempo de campo brillante. Haga clic en Cargar imágenes GFP y seleccione la imagen de pila de lapso de tiempo de EGFP. Seleccione GFP en la lista desplegable de la GUI (Figura 8A, cuadro rojo). Haga clic en ROI para especificar la región rectangular de interés (ROI), incluido el cono de crecimiento, haciendo clic en dos puntos en la imagen de celda que se muestra en la GUI (Figura 8B). Haga clic en el botón Guardar en la GUI (Figura 8A, flecha roja). Las imágenes de pila seleccionadas, junto con el ROI, se guardarán en un archivo .mat (archivo de formato MATLAB). Haga clic en Detectar spot. Aparecerá un cuadro de diálogo en la pantalla. Introduzca un valor (normalmente 50-150) en el cuadro de diálogo para determinar un umbral para la detección de cuentas. Al hacer clic en Aceptar , se inicia el cálculo. Después de finalizar el cálculo, haga clic en Trazar pista para ampliar la región seleccionada en el paso 8.12.8 y mostrar las cuentas detectadas como puntos blancos (Figura 8C, 1).NOTA: Confirme si la detección de cuentas (puntos blancos) se superpone con las cuentas fluorescentes. La detección de cuentas también puede detectar ruido de fondo. Para reducir esta interferencia externa, cambie el valor umbral en Spot detect. Además, seleccione manualmente los puntos correctos en el paso 8.12.13. Haga clic en Seleccionar cuentas y demarque una región poligonal que incluya los puntos correctos debajo del cono de crecimiento. Pulse Intro en el teclado. Los puntos blancos dentro de la región poligonal cambiarán a un color rojo (Figura 8C, 2). Haga clic en Estimar fuerza en la GUI. Luego, ingrese valores para los siguientes parámetros: tamaño de píxel, μm / píxel; Módulo de Young, el valor calculado en el paso 7.2.5; Ratio de Poisson, 0,3. Ejecutar fuerza de estimación para iniciar el cálculo. El software guardará los resultados del cálculo en un archivo de formato de hoja de cálculo automáticamente.NOTA: La hoja de cálculo muestra el componente x, el componente y la magnitud de la fuerza en cada marco de tiempo (Figura 8D). Consulte el Archivo Suplementario 6 para obtener datos de práctica para cuantificar la fuerza de tracción.