3光子顕微鏡は、マウスやゼブラフィッシュの脳などの生体組織の奥深くで、高い時空間分解能で高コントラストの蛍光イメージングを可能にします。
2光子顕微鏡(2PM)や3光子顕微鏡(3PM)などの多光子顕微鏡技術は、細胞内分解能で深部組織 in vivo イメージングのための強力なツールです。3PMは、生物学実験室で広く使用されている2PMを超える深部組織イメージングに2つの主要な利点を有する:(i)〜1,300nmまたは〜1,700nmの励起レーザーを採用することにより、散乱組織における減衰長が長くなる。(ii)高次非線形励起によるバックグラウンド蛍光発生が少ない。その結果、3PMは、皮質層から海馬および成体ゼブラフィッシュの前脳全体まで、無傷のマウス脳などの散乱組織の奥深くにある高コントラストの構造的および機能的イメージングを可能にする。
今日、3PMに適したレーザー光源が市販されており、既存の2光子(2P)イメージングシステムを3光子(3P)システムに変換することができます。さらに、複数の市販の3P顕微鏡が利用可能であるため、この技術は生物学研究所で容易に入手可能です。この論文は、典型的な3PMセットアップの最適化、特にすでに2Pセットアップを持っている生物学グループを標的とし、無傷のマウスおよび成体のゼブラフィッシュ脳における生体内3Dイメージングを実証する。このプロトコルは、顕微鏡アライメント、約1,300および〜1,700nmのレーザーパルスのプレチャーピング、動物の準備、および成体のゼブラフィッシュおよびマウス脳の深部における生体内3P蛍光イメージングを含む、3Pイメージングの完全な実験手順をカバーしています。
生命科学では、2PMや3PMなどの多光子顕微鏡(MPM)技術は、散乱組織において高い時空間分解能と高いコントラストを備えた深部in vivoイメージングのための強力なツールとなっています。さらに、これらの方法は、1光子共焦点顕微鏡1、2、3、4と比較して、より少ないフォトブリーチングを引き起こす。3PMは、(i)より長波長励起(〜1,300nmまたは〜1,700nm)の採用が組織散乱を減少させ、および(ii)高次励起プロセス(すなわち、蛍光シグナルが2PMにおける励起電力の2乗ではなく、3PMにおける励起電力の3乗に依存する)の2つの主要な特徴のために、2PMと比較してより深い組織イメージングに有利である3.その結果、3PMは、無傷の成体マウス脳3、5、6、7、8、9、10、11およびCa2+を含む成体ゼブラフィッシュ12の前脳全体における海馬などの生体組織のより深い領域での高コントラストイメージングを可能にする。 アクティビティの記録と多色の観察。さらに、マウスおよび成体のゼブラフィッシュ12、13の無傷の頭蓋骨を通して3PMで高コントラストの画像が得られている。
今日、〜1,300および〜1,700nmでの3P励起(3PE)に適した励起レーザー光源が市販されている。レーザースキャニングシステムは2PMと3PMで本質的に同じであるため、3PE用の市販のレーザーを設置することで、生物学研究室で既存の2Pセットアップを3Pセットアップに変換することができます。3P蛍光信号は、対物レンズのレーザーパワー、パルス持続時間、レーザー繰り返し速度、および開口数(NA)に依存する。回折制限焦点(すなわち、対物レンズの背面開口が励起ビームによって過充填される)を仮定すると、Eq(1)は、3PEから生じる焦点体積からの時間平均化された蛍光光子束を記述する。
(1)
ここで、fはレーザー繰り返し速度、τはレーザーパルス持続時間(半値全幅)、φはシステム収集効率、ηは蛍光量子効率、σ3は3P吸収断面、Cは蛍光色素濃度、n0は試料媒質(例えば水)の反射指数、λは真空中の励起波長、 NAは対物レンズの開口数、3は焦点体積の空間積分定数、対物レンズ下の時間平均励起光子束(光子/s)、zは結像深度、EALは有効減衰長14である。ここでは、EAL(通常は100μm>)が顕微鏡の軸方向分解能(通常は10μm<)よりもはるかに大きいと仮定しました。近軸近似では、a3 は 28.114 に等しくなります。gp(3) は励起源の 3次時間コヒーレンスであり、gp(3) は双曲線 – 正割二乗パルスとガウスパルスでそれぞれ 0.41 と 0.51 です。φ集光効率は、対物レンズによる蛍光の捕集、対物レンズの透過率、ダイクロイックミラーの反射率、フィルタの透過率、検出器(例えば、光電子増倍管、PMT)の検出効率などを考慮することにより推定することができる。3P蛍光強度は様々なパラメータに大きく依存するため、3P蛍光シグナルを最大化するには3Pセットアップの最適化が必要である。
このプロトコルは、典型的な3Pセットアップの最適化プロセスを示しており、特に2Pセットアップを持ち、その機能を3Pイメージングに拡張したり、商用3Pセットアップを最適なパフォーマンスで維持したりする生物学研究所に役立ちます。このビデオ記事はまた、生きている動物の脳における深部組織3Pイメージングを示しています。最初のセクションでは、市販のレーザー光源と多光子顕微鏡による典型的な3Pセットアップの最適化について説明します。第2および第3のセクションでは、ニューロンの構造および活動の3PMに対するゼブラフィッシュおよびマウスの調製についてそれぞれ説明する。マウス開頭手術は、プロトコル論文でも以前に報告されている15,16,17.第4のセクションでは、ゼブラフィッシュとマウスの脳における生体内3Pイメージングを実証します。
このプロトコルでは、市販の顕微鏡とレーザー光源を使用して3Pイメージングを設定するための手順を段階的に説明します。2PMと比較して、3PMは、マウス脳海馬などのより深い領域での光アクセスを必要とするアプリケーションにおいて利点を有する。3PMは主に神経科学で使用されていますが、3PMはリンパ節、骨、腫瘍などの他の組織にも深部組織観察のために適用される可能性があります。
イメージングシステムがショットノイズの限界に近い状態で動作し、検出およびデータ集録エレクトロニクスがPMT後の画像に無視できる程度のノイズで寄与することを確認することが重要です。検出される光子の数の不確実性は、光子ショットノイズによって根本的に制限される。ショットノイズ制限性能は、高利得光検出器(例えば、PMT)を使用する典型的な多光子顕微鏡において達成することができる。フォトンショットノイズはポアソン統計分布に従い、分布の標準偏差は分布の平均の平方根に等しくなります。ショットノイズが制限された性能を確認するには、プロトコルセクションのステップ 1.14 に従います。
H2Oによる光減衰を避けるために、浸漬にD2Oを使用することは、特に〜1,700nmの励起に有用である。D2Oを使用する場合、撮像中のD2O/H2O交換を避けるために、約10分ごとにD2Oをリフレッシュするか、大量のD2Oを使用することが不可欠である。また、室内環境3からD2Oを密閉することもできる。長い作動距離(WD)対物レンズ(例えば、4mm以上のWD)を撮像に使用する場合、浸漬液厚は2〜3mmを超える可能性がある。増加した厚さは、H2O吸収を〜1,300nm21でも無視できないものにする。そのため、長尺WD対物レンズを用いる場合には1,300nm3PMに対してもD2Oが必要となり得る。
3P蛍光強度は焦点における励起パルスエネルギーの3乗に依存するため(式(1))、適切なレーザーパワーを設定することは、生体組織における熱的および非線形損傷を回避しながら適切な3P蛍光信号を得るために特に重要である。平均レーザー出力は、熱損傷しきい値未満に抑える必要があります。例えば、マウス脳では、熱組織損傷を避けるために、マウス脳表面の平均電力は、1mmの深さで、視野(FOV)が230μm x 230μm21で〜1,300nmの励起に対して〜100mW以下に保たれるべきである。同様に、~1,700 nmの平均出力は、~1 mmの深さで~50 mW以下、視野は~230 μm x 230 μm(未発表データ)に維持する必要があります。さらに、励起飽和および潜在的な非線形損傷を避けるために、励起パルスエネルギーは、それぞれ〜1,300nmおよび〜1,700nm励起30に対して2nJおよび3nJに維持されるべきである。
組織における光吸収および散乱のために、焦点でのパルスエネルギーは、1 EALによる組織の浸透後に1/e(〜37%)に減衰される。EALは、異なる組織および励起波長によって変化し、例えば、マウス脳の新皮質において、EALは、それぞれ〜1,300nmおよび〜1,700nmで〜300μmおよび〜400μmである(図5)。したがって、同じパルスエネルギーをn個のEALの深さで焦点(例えば、1nJ/パルス)に保つには、表面パルスエネルギーに1nJ×esを掛ける必要がある。構造的および機能的ダイナミクスの高速イメージングのためには、高いフレームレート5、6、7、10を達成するために、高い繰り返しレート(1MHz以上)を有する励起レーザが望ましい。ただし、パルスエネルギー要件と平均レーザー出力制限により、適用可能な繰り返し速度が制限されます。
例えば、4つのALA(すなわち、1,300nmの励起でマウス皮質で〜1.2mm)で適度に深い領域を画像化する場合、1nJ/パルスを焦点を合わせ続けるために表面で〜55nJ/パルスが必要です。平均電力制限が100mWの場合、約2MHzのレーザー繰り返しレートを適用できます。しかし、7 EALの深さでより深く画像化するには、焦点が合って1 nJ/パルスを維持するために、表面で約1,100 nJ /パルスが必要です。熱損傷を避けるために最大平均電力が100mWであると仮定すると、表面で1,100nJ/パルスを達成するためには、レーザー繰り返しレートを0.1MHzに低減する必要があります。 表 1は、マウス脳皮質における典型的な画像化条件をまとめたものである。なお、 表 1の撮像深度は、EALがマウス皮質全体で均一であると仮定する。
さらに、深部組織3PMにおけるレーザーパワーの制限のために、フレームレートと画像画素サイズとの間にトレードオフが存在し、これはカルシウムイメージングなどの機能的イメージングにとって特に重要である。利用可能な最大レーザー繰り返し速度は、焦点時の必要なパルスエネルギーと、上記で説明した適用可能な平均レーザー出力(例えば、1,300nm励起で〜4つのEALに相当する深さでの2MHz)に基づいて、各深さで決定されます。一般に、イメージングには、ピクセルごとに少なくとも 1 つのパルスが必要です。したがって、使用可能な最小ピクセル滞留時間は、レーザー繰り返し速度(例えば、2MHz励起で0.5μs/ピクセル)によって決定されます。
画像で高い空間分解能 (横方向で約 1 μm) を維持するには、1 ピクセルを約 1 μm 2 の領域に設定するのが理想的です (たとえば、250 x 250μm 2 の FOV に対して 256 x 256 ピクセル)。したがって、かなり大きなFOV(例えば、256 x 256ピクセルで250 x 250 μm 2)で高速イメージングを実行するには、0.5 MHz、1 MHz、および2 MHzのパルス繰り返しレートは、それぞれ〜7.6、〜15、および〜30フレーム/秒の理論上の最大フレームレートを与える。同様に、レーザー繰り返し速度の最適化は、ターゲット深度、スキャン速度、およびFOVに応じて、熱損傷閾値の下で適切なパルスエネルギーを適用するために不可欠です。画像化速度を増加させるために、適応励起源を使用して、ニューロン31にオンデマンドでレーザーパルスを送達することによって、すべての励起パルスをニューロン(すなわち、関心領域)に集中させることができる。
3PMは、生体組織内の深部イメージングや、マウス脳の頭蓋骨、骨、白質層(すなわち、外部カプセル)などの散乱性の高い媒体を介した深部イメージングにおいて、2PMと比較すると有利である。EALが長く、3PEの高次非線形励起が長いほど、深部組織イメージングに利益をもたらします。例えば、マウス皮質のGCaMP6を画像化すると、920 nmの励起を伴う2P蛍光シグナルは、690 μmの浅い領域 における1,300 nm励起を有する3P蛍光シグナルよりも高い(すなわち、1,300nmで〜2.3 EAL)21。しかし、920nmと比較して1,300nmでのEALが長いため、3PEは〜690μmの深さおよびより深い21で2P励起(2PE)よりも強い蛍光を与える。この深さは「シグナルクロスオーバー深さ」として定義され、2PEおよび3PEの蛍光信号強度は同じ繰り返し速度および同じ最大許容平均乗21で同一である。信号クロスオーバー深度は、2PEと3PEの励起波長と蛍光色素分子によって異なります。
実際には、920nm励起は、吸水率が低いため、1,300nm励起よりも高い平均レーザー出力を可能にします。ただし、平均検出力が2PEが高いほど、信号クロスオーバー深度は0.9 EAL4だけ押し上げられます。さらに、サンプルが高密度に標識されている場合、3PEははるかに高いSBRという追加の利点を有する。したがって、信号クロスオーバー長に達する前であっても、2PMよりも3PMの方がイメージングに適している可能性があります。例えば、〜2%の体積分率(すなわち、標識密度)を有するマウス脳血管系を画像化する場合、フルオレセインについて〜700μmの深さで200mWの励起電力を有する1,300nmの3PMが、100mWの励起電力を有する920nm2PMを上回る。
3PMはまた、励起ビームの点像分布機能を歪め、デフォーカス背景4を生成する可能性がある、薄いが散乱性の高い層を介して撮像する場合にも利点を有する。例えば、マウス脳の無傷の頭蓋骨を通して、2PM画像は、脳表面13から<100μmの浅い深さにおいても焦点ずれの背景に苦しんでいる。同様のデフォーカス背景が、マウス脳32内の白質を通る1,280nm励起を有する2PMにおいて観察された。したがって、組織を濁った層を通して画像化する場合、標識密度にかかわらず、高コントラストイメージングのためには3PM〜2PMが好ましい。
私たちは最近、3PMのイメージング深度限界が8 EAL33を超えていることを示すビーズファントムと理論分析を報告しました。8つのEALは、マウス皮質における〜1,700nmの励起で〜3mmに相当する。しかし、現在利用可能なレーザーは、マウス脳内で8つのEALを達成するのに十分なパルスエネルギーを持っていません。より強力なレーザーのさらなる開発は、現在のイメージング深度限界である3PMを押し上げるでしょう。
The authors have nothing to disclose.
この研究はNSF DBI-1707312 Cornell NeuroNex HubとNIH 1U01NS103516によって支援された。
5% Povidone-iodine | Amazon | NDC 67818-155-32 | Aceptical cleaning of surgical areas |
70% Ethanol | Thermo Fisher Scientific | CAS 64-17-5 | Aceptical cleaning of surgical areas |
Agarose | Sigma | A4718-256 | Preparing zebrafish chamber |
Atropine | Cornell Veterinary Care | ||
Bergamo II | Thorlabs | Multiphoton Imaging Microscope | |
Bupivacaine | Cornell Veterinary Care | ||
Dexamethasone | Cornell Veterinary Care | ||
Donut shape glass (ID4.5, OD6.5) | Potomac Photonics | Cover glass used for craniotomy | |
eye ointment (or topical ophthalmic ointment) | Puralube Vet Ointment | NDC 17033-211-38 | Used as a lubricant to prevent irritation or to relieve dryness of the eye during surgery and anesthesia |
GaAsP Amplified PMT | Thorlabs | PMT2100 | PMT detector |
Glucose | Cornell Veterinary Care | ||
Glycopyrrolate | Cornell Veterinary Care | ||
Heater (800 W) | Finnex | Aquarium heater for zebrafish water) | |
Isoflurane USP 250 mL | Piramal | NDC 66794-0013-25 | For anesthesia of mice |
Ketoprofen | Cornell Veterinary Care | ||
Kimwipes | Kimtech | Laboratory tissue for preparing zebrafish | |
Nanofil syringe (10 micrometer) with 36 G needle | WPI | NANOFIL + NF36BV | Syringe and needle for injection of pancuronium bromide |
Optical Adhesive | Norland | NOA 68 | To stick round coverslip and donut shape glass together. |
Pancuronium Bromide | Cornell Veterinary Care | ||
Peristaltic Pump | Elemental Science | ESI MP2 | Water pump for zebrafish setup |
Polyethylene tubing (I.D. 0.58 mm., O.D. 0.965 mm.) | Elemental Science | MP2 pump tubing | Tubing that goes in the mouth of the zebrafish |
Round Cover Slip German Glass #1.5, 5 mm | Electron Microscopy Sciences | 7229605 | Cover glass used for craniotomy |
Spirit-NOPA | Spectra Physics | Tunable Optical Parametric Amplifier | |
SR400 | Stanford Research Systems | SR400 | Photon counter |
Standard Photodiode Power Sensor | Thorlabs | S122C | Power detector |
Sterilized phosphate buffered saline (PBS) | Millipore Sigma | SKU 806552-500ml | Used during mouse brain surgery |
Surgical drape | Dynarex disposable towel drape | 4410 | For aceptical mouse surgery |
Thin strip boxing wax | Corning Rubber Co., Inc. | Holding tubing in place in zebrafish chamber | |
ThorImage | Thorlabs | Image acquisition software | |
Tricaine (Ethyl-m-aminobenzoate methanesulfonate salt) | MP | 103106 | Zebrafish anesthesia and euthanasia |
Tygon tubing (I.D. 1/16 in., O.D. 1/8 in.) | Tygon | Tubing for water flow for zebrafish preparation | |
VaporGuard | VetEquip | 931401 | For recycling isoflurane |
Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | To glue the glass window on the mouse skull, and to glue the laboratory tissue when preparing the fish. |
XLPLN25XWMP2 | Olympus | Multiphoton Excitation Dedicated Objective |