Summary

Uma plataforma flexível para monitorar o aprendizado associativo sensorial dependente do cerebellum

Published: January 19, 2022
doi:

Summary

Desenvolvemos uma única plataforma para rastrear o comportamento animal durante duas tarefas de aprendizagem associativa dependentes de fibras. O design de baixo custo permite a integração com experimentos optogenéticos ou de imagem direcionados à atividade cerebelar associada à fibra.

Abstract

As entradas de fibra de escalada para as células Purkinje fornecem sinais instrutivos críticos para o aprendizado associativo dependente do cerebelo. Estudar esses sinais em camundongos fixos na cabeça facilita o uso de métodos de imagem, eletrofisiológico e optogenético. Aqui, foi desenvolvida uma plataforma comportamental de baixo custo (~US$ 1000) que permite o rastreamento do aprendizado associativo em ratos fixos que locomotem livremente em uma roda de corrida. A plataforma incorpora dois paradigmas comuns de aprendizagem associativa: condicionamento de olho e condicionamento tátil retardado. O comportamento é rastreado usando uma câmera e o movimento da roda por um detector. Descrevemos os componentes e a configuração e fornecemos um protocolo detalhado para treinamento e análise de dados. Esta plataforma permite a incorporação de estimulação optogenética e imagens de fluorescência. O design permite que um único computador hospedeiro controle várias plataformas para treinar vários animais simultaneamente.

Introduction

O condicionamento pavloviano da associação subcaída entre estímulos para obter uma resposta condicionada tem sido usado há muito tempo para sondar o aprendizado dependente de cerebelar. Por exemplo, no condicionamento clássico de desintegação (DEC), os animais aprendem a fazer um piscar de proteção bem cronometrado em resposta a um estímulo condicional neutro (CS; por exemplo, um flash de luz ou tom auditivo) quando é emparelhado repetidamente com um estímulo incondicional (EUA; por exemplo, um sopro de ar aplicado à córnea) que sempre provoca um reflexo piscando, e que vem no final ou perto do CS. A resposta aprendida é referida como uma resposta condicionada (CR), enquanto a resposta reflexa é referida como a resposta incondicionada (UR). Em coelhos, lesões específicas de cerebelo interrompem essa forma de aprendizado 1,2,3,4. Além disso, os picos complexos de células Purkinje, impulsionados por suas entradasde fibra de escalada 5, fornecem um sinal necessáriode 6,7 e 8,9 suficientes para a aquisição de CRs devidamente cronometrado.

Mais recentemente, paradigmas de aprendizagem associativa dependentes de fibras foram desenvolvidos para ratos com fixação de cabeça. O DEC foi o primeiro paradigma de aprendizagem associativa a ser adaptado a essa configuração10,11. DEC em camundongos fixos na cabeça tem sido usado para identificar regiões cerebelares 11,12,13,14,15,16,17 e elementos de circuito11,1 2,13,14,15,18,19 que são necessários para aquisição e extinção de tarefas. Essa abordagem também tem sido usada para demonstrar como a representação fisiológica de nível celular dos parâmetros de tarefa evolui com o aprendizado 13,15,16.

Além do eyeblink, o paradigma de condicionamento tátil de início de partida (DTSC) foi recentemente desenvolvido como uma nova tarefa de aprendizagem associativa para ratos fixos na cabeça20. Conceitualmente semelhante ao DEC, o DTSC envolve a apresentação de um CS neutro com um US, um toque no rosto suficiente em intensidade para engajar um reflexo de medo 21,22 como ur. No paradigma DTSC, tanto a UR quanto a CR são lidas como locomoção retrógrada em uma roda. O DTSC tem sido usado agora para descobrir como o aprendizado associativo altera a atividade cerebelar e os padrões de expressão genética20.

Neste trabalho, foi desenvolvido um método para aplicar de forma flexível o DEC ou DTSC em uma única plataforma. Os atributos de estímulo e plataforma são esquematizados na Figura 1. O design incorpora a capacidade de rastrear o comportamento animal com uma câmera, bem como um codificador rotativo para rastrear a locomoção do rato em uma roda. Todos os aspectos da estrutura de registro e ensaio de dados são controlados por microcontroladores emparelhados (Arduino) e um computador de placa única (SBC; Raspberry Pi). Esses dispositivos podem ser acessados através de uma interface de usuário gráfica fornecida. Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho para configuração, preparação e execução de experimentos e um pipeline de análise personalizado para visualização de dados.

Protocol

Os protocolos animais descritos aqui foram aprovados pelos Comitês de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Princeton. 1. Configuração do SBC Conecte o cabo de interface serial da câmera (CSI) à câmera Raspberry NoIR V2 e à porta da câmera no SBC. Baixe o sistema operacional para o SBC no computador hospedeiro. Escreva a imagem do sistema operacional para um cartão digital micro seguro (microSD).NOTA: Instruções detalhadas para estes p…

Representative Results

Fluxo de trabalho para experimentos e análises de DECA seleção adequada de parâmetros experimentais é importante para o treinamento bem sucedido de condicionamento de de atmoscção (DEC). Para os dados aqui apresentados, a GUI foi utilizada para escolher uma duração CS de 350 ms e uma duração norte-americana de 50 ms. Essa combinação resulta em um intervalo de inter-estímulo de 300 ms: tempo suficiente para evitar a produção de CR de baixa amplitude10 e curto o …

Discussion

A plataforma com protocolos associados aqui descritos pode ser usada para rastrear de forma confiável o comportamento animal em duas tarefas de aprendizagem associativa sensorial. Cada tarefa depende da comunicação intacta através da via de fibra de escalada. No design aqui descrito, incorporamos elementos para facilitar o aprendizado e gravação/perturbação da resposta cerebelar. Estes incluem uma roda para permitir locomoção gratuita 11,18, bem como fi…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho é apoiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde Mental NRSA F32 MH120887-03 (para G.J.B.) e R01 NS045193 e R01 MH115750 (para S.S-H.W.). Agradecemos aos Drs. Bas Koekkoek e Henk-Jan Boele por discussões úteis para otimizar a configuração do DEC e os Drs. Yue Wang e Xiaoying Chen por discussões úteis para otimizar a configuração do DTSC.

Materials

"B" Quick Base For C&B METABOND – 10 mL bottle Parkell S398 Dental cement solvent
"C" Universal TBB Catalyst – 0.7 mL Parkell S371 Catalyst
#8 Washers Thorlabs W8S038 Washers
0.250" (1/4") x 8.00" Stainless Steel Precision Shafting Servocity 634172 1/4" shaft
0.250” (0.770") Clamping Hub Servocity 545588 Clamping hub
1/4" to 6 mm Set Screw Shaft Coupler- 5 pack Actobotics 625106 Shaft-coupling sleeve
1/4"-20 Cap Screws, 3/4" Long Thorlabs SH25S075 1/4" bolt
100 pcs 5 mm 395–400 nm UV Ultraviolet LED Light Emitting Diode Clear Round Lens 29 mm Long Lead (DC 3V) LEDs Lights +100 pcs Resistors EDGELEC ‎ED_YT05_U_100Pcs CS LEDs
2 m Micro HDMI to DVI-D Cable – M/M – 2 m Micro HDMI to DVI Cable – 19 pin HDMI (D) Male to DVI-D Male – 1920 x 1200 Video Star-tech ‎HDDDVIMM2M Raspberry Pi4B to monitor cable
256 GB Ultra Fit USB 3.1 Flash Drive SanDisk ‎SDCZ430-256G-G46 USB thumb drive
3.3 V–5 V 4 Channels Logic Level Converter Bi-Directional Shifter Module Amazon B00ZC6B8VM Logic level shifter
32 GB 95 MB/s (U1) microSDHC EVO Select Memory Card Samsung ‎MB-ME32GA/AM microSD card
4.50" Aluminum Channel Servocity 585444 4.5" aluminum channel
48-LED CCTV Ir Infrared Night Vision Illuminator Towallmark SODIAL Infrared light array
4PCS Breadboards Kit Include 2PCS 830 Point 2PCS 400 Point Solderless Breadboards for Proto Shield Distribution Connecting Blocks REXQualis B07DL13RZH Breadboard
5 Port Gigabit Unmanaged Ethernet Network Switch TP-Link ‎TL-SG105 Ethernet switch
5 V 2.5 A Raspberry Pi 3 B+ Power Supply/Adapter Canakit ‎DCAR-RSP-2A5 Power supply for Raspberry Pi 3B+
5-0 ETHILON BLACK 1 x 18" C-3 Ethicon 668G Sutures
6 mm Shaft Encoder 2000 PPR Pushpull Line Driver Universal Output Line Driver Output 5-26 V dc Supply Calt  B01EWER68I Rotary encoder
Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 1", 5 Pack Thorlabs TR1-P5 Optical posts
Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 2", 5 Pack Thorlabs TR2-P5 Optical posts
Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 4", 5 Pack Thorlabs TR4-P5 Optical posts
Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 6", 5 Pack Thorlabs TR6-P5 Optical posts
Ø1/2" Post Holder, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L = 2" Thorlabs PH2 Optical post holder
Adapter-062-M X LUER LOCK-F The Lee Co. TMRA3201950Z Solenoid valve luer adapter
Aeromat Foam Roller Size: 36" Length Aeromat B002H3CMUE Foam roller
Aluminum Breadboard 10" x 12" x 1/2", 1/4"-20 Taps Thorlabs MB1012 Aluminum breadboard
Amazon Basics HDMI to DVI Adapter Cable, Black, 6 Feet, 1-Pack Amazon HL-007347 Raspberry Pi3B+ to monitor cable
Arduino  Uno R3 Arduino A000066 Arduino Uno (microcontroller board)
Arduino Due Arduino ‎A000062 Arduino Due (microcontroller board)
Bench Power Supply, Single, Adjustable, 3 Output, 0 V, 24 V, 0 A, 2 A Tenma 72-8335A Power supply
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet, 12" x 24" x 1/8" McMaster Carr 8560K257 Acrylic sheet
CNC Stepper Motor Driver 1.0–4.2 A 20–50 V DC 1/128 Micro-Step Resolutions for Nema 17 and 23 Stepper Motor Stepper Online B06Y5VPSFN Stepper motor driver
Compact Compressed Air Regulator, Inline Relieving, Brass Housing, 1/4 NPT McMaster Carr 6763K13 Air source regulator
Cotton Swab Puritan 806-WC Cotton swab
Dell 1908FP 19" Flat Panel Monitor – 1908FPC Dell 1908FPC Computer monitor
Flex Cable for Raspberry Pi Camera Adafruit 2144 camera serial interface cable
High Torque Nema 17 Bipolar Stepper Motor 92 oz·in/65 N·cm 2.1 A Extruder Motor Stepper Online 17HS24-2104S Stepper motor
Isoflurane Henry Schein 66794001725 Isoflurane
Krazy Maximum Bond Permanent Glue, 0.18 oz. Krazy Glue KG483 Cyanoacrylate glue
Lidocaine HCl VetOne 510212 Lidocaine
Low-Strength Steel Hex Nut, Grade 2, Zinc-Plated, 1/4"-20 Thread Size McMaster Carr 90473A029 Nuts
M3 x 50 mm Partially Threaded Hex Key Socket Cap Head Screws 10 pcs Uxcell A16040100ux1380 M3 bolt
NEMA 17 Stepper Motor Mount ACTOBOTICS 555152 Stepper motor mount
Official Raspberry Pi Power Supply 5.1 V 3 A with USB C – 1.5 m long Adafruit 4298 Power supply for Raspberry Pi 4B
Optixcare Dog & Cat Eye Lube Lubricating Gel, 0.70-oz tube Optixcare 142422 Opthalimic ointment
Precision Stainless Steel Ball Bearing, Shielded, Trade No. R188-2Z, 13000 rpm Maximum Speed McMaster-Carr 3759T57 Bearing
Premium Female/Female Jumper Wires – 40 x 6" Adafruit 266 Wires
Premium Female/Male 'Extension' Jumper Wires – 40 x 6" (150 mm) Adafruit 826 Wires
Premium Male/Male Jumper Wires – 40 x 6" Adafruit 758 Wires
Radiopaque L-Powder for C&B METABOND – 5 g Parkell S396 Dental cement powder
Raspberry Pi (3B+ or 4B) Adafruit 3775 or 4295 Raspberry Pi
Raspberry Pi NoIR Camera Module V2 – 8MP 1080P30 Raspberry Pi Foundation RPI3-NOIR-V2 Raspberry NoIR V2 camera
Right-Angle Bracket, 1/4" (M6) Counterbored Slot, 8-32 Taps Thorlabs AB90E Right-angle bracket
Right-Angle Clamp for Ø1/2" Posts, 3/16" Hex Thorlabs RA90 Right-angle optical post clamp
Right-Angle End Clamp for Ø1/2" Posts, 1/4"-20 Stud and 3/16" Hex Thorlabs RA180 Right-angle end clamp
RJ45 Cat-6 Ethernet Patch Internet Cable Amazon ‎CAT6-7FT-5P-BLUE Ethernet cable
Rotating Clamp for Ø1/2" Posts, 360° Continuously Adjustable, 3/16" Hex Thorlabs SWC Rotating optical post clamps
Spike & Hold Driver-0.1 TO 5 MS The Lee Co. IECX0501350A Solenoid valve driver
Swivel Base Adapter Thorlabs UPHA Post holder adapter
USB 2.0 A-Male to Micro B Cable, 6 feet Amazon ‎7T9MV4 USB2 type A to USB2 micro cable
USB 2.0 Printer Cable – A-Male to B-Male, 6 Feet (1.8 m) Amazon B072L34SZS USB2 type B to USB2 type A cable
VHS-M/SP-12 V The Lee Co. INKX0514900A Solenoid valve
Zinc-Plated Steel 1/4" washer, OD 1.000" McMaster Carr 91090A108 Washers

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Citar este artículo
Broussard, G. J., Kislin, M., Jung, C., Wang, S. S. -. A Flexible Platform for Monitoring Cerebellum-Dependent Sensory Associative Learning. J. Vis. Exp. (179), e63205, doi:10.3791/63205 (2022).

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