在胚胎第7.5天通过子宫内纳米注射（NEPTUNE）靶向小鼠神经板

根据欧洲法规饲养CD1野生型小鼠，具有标准的昼夜循环， 随意进食和饮水。CD1雌性与CD1雄配过夜，早晨检查阴道栓（E0.3）。注射时只使用怀孕的女性。此处描述的所有实验的伦理批准均由瑞典农业委员会（Jordbruksverket）授予。 1.玻璃针的制备：拉针和研磨 注意：虽然可以购买预磨针，但在内部拉针可以轻松调整针长、孔和斜角。 将玻璃毛细管安装到微量移液器/毛细管拉拔器中。使用指定的设备使用以下设置（请参阅 材料表）：加热580单位;速度140个单位;时间200单位;压力500-800单位。注意： 不同参数的单位由毛细管拉拔器定义。不同设备的单位可能有所不同。 按 拉动可 拉开毛细管，产生两个末端锥形的玻璃毛细管。注意：拉动后，由于微量移液器拉拔器的高温，两个玻璃毛细管的尖端熔断关闭。 用手术剪刀切割尖端以获得~7毫米的针长（从针开始变细的地方测量）（图1A）。注意：对于E7.5注射，细长的针头至关重要，因为注射区域非常小且脆弱。短孔和宽口径针会导致胚胎死亡。 研磨切割的针尖以形成锋利的斜面（图1C-F）。以最大速度以20°的角度研磨针头至少30-45分钟。注意：将超纯水添加到研磨板中以充当润滑剂，减少摩擦/温度并洗掉玻璃颗粒（图1B）。但是，多余的液体会减慢研磨机的速度。 确保针尖（图1C）接触磨板表面（图1D）但不弯曲（图1E）。注意：弯曲研磨会导致斜角不正确的长而脆弱的针尖，在注射过程中很容易折断。断针会伤害胚胎，必须用完整的针头代替。正确的接地尖端如图 1F，G所示。研磨后，所得针孔的内径（ID）预计为~15μm，外径（OD）为~35μm（图1G）。 用矿物油填充 1 mL 注射器并连接 27 G 针头。 取下针帽并将注射器针头插入新磨碎的玻璃毛细管中。注入矿物油，直到油从毛细管尖端滴落。在取出27G针头的同时继续注射，直到毛细管针头充满矿物油，然后可以取出注射器针头。 将磨碎和矿物油填充的针头存放在封闭的环境中，以防止损坏和灰尘积聚。为了储存，将两卷造型粘土插入普通培养皿中作为支架（图1H）。轻轻地将针架在粘土上，并将它们分开，以便于取回针。注意：由于针头准备非常耗时，因此最好在注射前至少一天准备针头。最多两窝后丢弃针头，因为它们会变钝。始终准备备用针头，以防在制备或注射过程中针头损坏。 图 1：用于 E7.5 羊膜腔注射的针头制备。 （A） 拉动但未切割的玻璃毛细管针（左）、以最佳长度切割用于 E7.5 注射的毛细管针（中）和毛细管切割太短（右）的代表性示例。（B）水覆盖均匀的研磨机，准备进行针磨。（C-F）不同针尖的代表性示例。（C） 切开但未研磨的针尖安装在研磨机中;（四）理想的磨削位置，针尖刚好接触磨床;（五）磨削过程中针放得太远而弯曲的;（F）用于E7.5交流电注入的理想接地针尖。（G）显示内径~15μm，外径~35μm的孔的研磨针尖，适用于E7.5 AC注入。针孔显示为虚线。外径用红色箭头表示;内径用蓝色箭头表示。（H）针头储存：培养皿中装满拉针和磨针。两排造型粘土用作支架。注意：对于C，F，G的目测千分尺，1厘米分为100个间距;目标是 3 倍;因此，1 间距 = 10，000 μm/（100 × 3） ≈ 33.4 μm。缩写：AC = 羊膜腔;ID = 内径;OD = 外径。请点击此处查看此图的大图。 2.注射前一天：准备工作台进行妊娠超声验证 注意：使用慢病毒时，所有工作都应在通风的生物安全2级（BSL 2）工作台上进行。妊娠超声验证可在通风工作台上进行。 打开超声波机、加热台和异氟醚泵的 O2 电源（可能因设备而异）。注意：检查异氟烷系统，确保异氟烷没有泄漏到空气中。 将一个空的废物袋（胶带贴在内壁上以便于取用）、脱毛膏、无菌包装棉签、水、纸巾和手术胶带放在 BSL 2 工作台内。 准备四片手术胶带（~7厘米长），以在怀孕的超声检查期间固定小鼠四肢。 3. 超声波检查以确认怀孕 注意：此步骤可以在E7.5注射前一天在E6.5执行。有关胎龄检查的详细信息，请参阅讨论。 将时间配对的雌性小鼠放在诱导室中。 以~2.1LPM的氧气流量和3-4%异氟醚的初始剂量打开气流以诱导麻醉。 通过检查爪反射来验证雌性是否完全麻醉。如果爪反射不存在，将异氟醚降低至1.5-2%。注意：诱导麻醉大约需要 3 分钟。 将气流从感应室切换到加热台鼻锥。 将麻醉的女性仰卧位（腹部向上）放在加热台上，并将鼻子放在连接的鼻锥中，以确保在怀孕超声检查期间维持麻醉。 用准备好的手术胶带将所有四只爪子固定在桌子上，不要拉伸雌性的身体或困住胡须。 在下腹部涂抹豌豆大小的脱毛霜。使用棉签将乳膏涂抹在下腹部（A ~ 3 x 3 cm square），然后来回滚动棉签轻轻按摩。 一旦皮毛开始从皮肤上脱落，请弄湿纸巾并去除奶油和毛皮。用湿纸巾清洁去毛的区域，直到所有的乳霜和头发都消失。擦干皮肤。 在剃须区域涂抹李子大小的超声凝胶，然后通过以下三种方法中的任何一种使用超声波识别子宫。要手动执行此操作，请将超声探头放在超声凝胶中并移动探头以找到子宫。 对于半手动方法#1，通过沿x平面松开和移动导轨的一部分，将超声探头（连接到栏杆系统）放置在女性腹部上方。将超声探头降低到凝胶（z平面）中并扫描下腹部（y平面）（图2A）。 对于半手动方法#2，将超声探头（连接到栏杆系统）降低到凝胶中以对下腹部进行成像。在此过程中保持超声探头静止，并沿x和/或y平面移动带有附加轮子的加热台（图2B）。注意：在这些早期胚胎阶段，内部器官，例如肠道，在超声成像中可能看起来与子宫相似。然而，虽然胚胎和蜕膜显示为一系列球体（类似于项链上的珠子），但肠道具有连续管的外观。可以通过来回扫描感兴趣的结构来评估腔空间（单独的球体与连续管）的连通性，以确定该结构是离散球体（胚胎/蜕膜）（图2C）还是连续管（肠）（图2D）。在这个阶段，没有必要记录胚胎的数量;确认它们的存在与否就足够了。 确定怀孕状态后，将超声探头从腹部抬起，用湿纸巾擦拭下腹部以去除超声凝胶。 关闭异氟醚泵并取下手术胶带以释放爪子。 将雌性置于俯卧位（腹部朝下）放入40°C加热板上的干净笼子中。密切观察女性，直到她恢复意识，这需要 2-6 分钟。注意：确保一名女性的超声波检查时间为<10分钟，以尽量减少接触异氟醚。 清除所有材料和废物，并用70%乙醇清洁所有表面。用干燥、柔软且不起毛的纸巾擦去超声探头上残留的超声凝胶。关闭超声机、通风工作台/ BSL2工作台，加热台和O2 电源。 4. 胚胎分期超声检查 注意：此步骤在手术前进行，用于根据AC大小对怀孕的女性进行分层。这一步在E7.5中至关重要，因为目标是针对发展中的中枢神经系统。在发育的早期阶段，发育中几个小时的差异会显着影响AC的大小和神经形成的进展。 按照步骤3.1-3.5中的步骤麻醉第一只怀孕的雌性小鼠。 按照步骤3.6中所述将雌性放在桌子上并固定。 将李子大小的超声凝胶涂在剃光的腹部，然后降低超声探头以对女性的下腹部进行成像。注意：此步骤假设女性在前一天接受了超声波检查怀孕，并且已经去除了腹部的皮毛。如果不是这种情况，则必须在按照步骤3.7-3.8添加超声凝胶之前去除皮毛。在E7.5，子宫和蜕膜更大，更容易与内脏区分开来。此外，AC较大，可以与外切体腔（ExC）区分开来。 尽可能完整地扫描左右子宫角。注意：有些胚胎位于女性体内的更深处，可能会被遗漏。 记录胚胎的数量和阶段。记下理想大小的羊膜腔，可接受的腔和没有腔的蜕膜的数量（图2E-G）。 对所有怀孕进行分期并相应地进行排名。 按照步骤4.5-4.7中的说明，在超声检查（步骤4.4）后立即向女性注射大部分理想大小的AC。 对于大多数可接受的女性（其中外丝体和羊膜腔尚未明确分为两个腔）或不存在空腔，推迟注射并在几个小时后再次分期。如果大多数腔仍然太小，请将注射推迟10-12小时。 图2：超声检查期间羊膜腔的检查和分期。 （A） 带有超声波探头、纳米注射器和加热台的轨道系统概述。超声探头可以在 x、y 和 z 平面上移动，以实现与女性腹部或 AC 的最佳对齐。（B）加热台可以通过X和/或Y平面上的两个轮子移动，以便精确扫描和评估AC，而超声探头可以保持静止。（C）超声检查期间女性腹部内E6.5蜕膜的代表性超声图像以确认怀孕（白色虚线轮廓）。此时尚未形成空腔;然而，有时，胎盘外锥（白色星号）是可见的。蜕膜可以通过它们的球形来识别，并与肠道区分开来，肠道表现为一个连续的管子。（D）小肠的代表性图像序列（白色虚线轮廓），通过下腹部连续扫描。（E-G）E7.5注射前腔分期期间的代表性超声图像。羊膜腔和外丝体腔已经形成并被羊膜隔开。胎盘外锥是主要的血液供应，在超声检查中是一个亮点。AC位于胎盘外锥最远端。（E）理想大小的AC看起来比外塞体腔大，而中等大小的腔看起来更小（F）。如果没有可见的空腔（G），这意味着胚胎已被再吸收或尚未达到E7.5。比例尺 = 1 毫米。 缩写：A = 羊膜;AC = 羊膜腔;ExC = 外腔;EC = 胎盘外锥。请点击此处查看此图的大图。 5.注射日：准备BSL2手术台 将一块弹性膜粘在市售的改良培养皿的圆形中央开口上。确保膜很好地附着在培养皿上以防止泄漏。注意：如果培养皿泄漏或粘合不充分，可以用胶带进一步固定弹性膜的边缘。 在弹性膜的中心做一个1-1.5厘米长的切口。 打开超声机、BSL2 工作台、加热板、异氟醚泵的 O2 电源和玻璃珠灭菌器（设置为 300 °C）。 在BSL2工作台内，放置一个空垃圾袋（贴在内墙上以便于取用）;无菌包装棉签（每次手术/每位女性使用新的棉签）;手术工具（剪刀、镊子、夹子、缝合线）和手术胶带;一整瓶室温磷酸盐缓冲盐水 （PBS）、一个用于废物收集的空瓶和一个 25 mL 移液器;一个带有弹性膜的培养皿用于手术;培养皿的盖子，用一滴水固定在盖子上的2 x 2-3 x 3厘米封口膜;造型粘土：4个较大的球或立方体（~3 x 3 x 3 cm3）和一个圆柱形（~4 x 1厘米）;带有镇痛剂（例如丁丙诺芬，0.05-0.1 mg / kg体重）和眼部凝胶的注射器注意：一旦将培养皿放在女性腹部顶部，造型粘土的球（或立方体）将用作培养皿的“脚”或支架/支架。圆柱形的粘土片将胚胎固定在培养皿内。如果注入多种溶液，或者在注射过程中需要重新填充针头，如果溶液可以间隔开，则可以使用同一块封口膜。 6. 针头装载 用薄纸擦去多余的矿物油，以获得更好的抓地力。注意：始终清洁远离尖端以防止损坏或受伤。 确保所有组件（一个密封O形圈，一个垫片和一个前垫圈 – 全部安装在夹头下方，图 3A）以正确的方向安装（图3B，移除夹头以进行可视化），以将毛细管针固定到位并形成气密连接，避免在推进或缩回针内的金属柱塞时形成气泡。 确保纳米注射器的金属柱塞完全缩回。按 Fill 进行验证，然后等待两声蜂鸣音，表示柱塞已完全缩回。 连接夹头但略微松动（拧开 45-90 度），将玻璃针滑到金属柱塞上，然后将毛细管针与金属柱塞一起推过前垫圈，直到它到达垫片（图 3C，D，取下夹头以进行可视化）。注意： 当柱塞穿过垫圈时会出现一些阻力，当它到达垫片时会减小。确保毛细管针牢固地插入垫片中以形成气密连接（图3D）。 通过拧紧纳米注射器的夹头来固定针头（牢固地拧回去）。注意：不要拧得过紧，因为这会压碎针头。 按 Empty 将 柱塞推入针中并从针尖排出油。如果玻璃针移动，请缩回柱塞，取出针头，然后重新加载。如果这导致形成气泡，请取下针头并重新填充矿物油。注意：正确固定的针头不应随柱塞移动。 将一滴病毒（~6μL）或其他注射溶液放在一块封口膜1 上（图3E;埃文斯蓝染料用于可视化目的）。注意：纳米注射器的最大体积为 ~5 μL。 按 Fill 产生一个气泡，作为油和溶液之间的分隔器（图 3F）。注意：这也可以作为填充或清空针头时的定位标记。 降低针头，将尖端浸入溶液中，然后按 Fill （图3F，G）。 观察气泡后加载溶液时的液位。按 Empty 以排出堵塞物，如果气泡变细而液体没有进入针头，则按 Fill 重新加载。如果这不能解决问题，请更换针头。 当针头满载（图3H）时，在z平面上抬起针头，并在尖端吸出少量空气，以防止针尖处的溶液蒸发和针头堵塞。 将带有连接针头的纳米注射器转向远离操作员，朝向工作台后部，以防止任何意外损坏或伤害。 图 3：将针头连接到纳米注射器和溶液加载。 （A）针头安装到纳米注射器之前的起始位置：金属柱塞完全缩回并连接夹头。（B）在夹头下方，用于固定和固定针头的所有三个组件按正确的顺序显示（从左到右）：密封O形圈（薄而黑），垫片（白色），带大孔的O形圈（黑色）（针必须通过）。为了确保气密连接，玻璃针在金属柱塞 （C） 上滑动并穿过前 O 形圈的开口，直到到达垫片 （D）。（E-H）将溶液装入针中。（E）将一滴溶液放在板盖上的封口膜上。（F）在加载溶液之前按Fill产生气泡，然后将针尖浸入溶液中。（G）溶液正在装入针中。（H）将溶液装入针中。注意：夹头已在（B-D）中取出以进行可视化，但在实验过程中应保持连接。固定针头的最后一步是拧紧夹头。埃文斯蓝染料用于E-H中的可视化。请点击此处查看此图的大图。 7. 注射 注意：此过程中使用的所有器械在手术前和每只小鼠之间都进行了消毒。 麻醉第一位具有理想大小空腔的女性（见第4节）。 将雌性放在桌子上并固定，如步骤3.1-3.6中所述。 将眼凝胶涂抹在眼睛上以防止角膜干燥，并在皮下注射止痛药。注意：推荐的镇痛药：丁丙诺啡（0.05-0.1毫克/千克体重）或氟尼辛（2.5毫克/千克）或类似药物，符合当地动物福利规定。多模式围手术期镇痛通过注射镇痛药和异氟醚维持。 用浸有0.5mg / mL氯己定溶液（或类似溶液）的布擦拭无菌准备下腹部并擦干皮肤。用手术剪刀在下腹部做一个1.5-2.0厘米的垂直中线皮肤切口。注意：按照当地批准的消毒程序准备手术区域。 轻轻抬起皮肤，将皮肤从切口点周围约1cm的底层肌肉层中解放出来，以方便手术后的缝合。 在肌肉层上做一个1厘米的垂直中线切口。 用一对镊子抬起皮肤和肌肉层的一侧，用另一对镊子寻找子宫角。注意：蜕膜像项链上的珠子一样排列，而肠是一个长而连续的管子（图4A）。 用镊子小心地从腹部拉出两个子宫角。将组织保持在胚胎之间;不要直接挤压它们（图4B）。注意：子宫在子宫颈处附着在身体上，两个卵巢/输卵管通过韧带连接。不要从这些锚点拉/分离子宫。 数数并记下左右两侧的胚胎数量。 对从卵巢到子宫颈或从子宫颈到卵巢的胚胎进行编号。注意：如果在胚胎阶段收集注射的胚胎，这一点尤其重要。 用湿棉签轻轻地将所有胚胎推回腹腔，除了前三个要注射的胚胎。 将一滴PBS滴在培养皿中的弹性上，并将其保持在胚胎上方。 将闭合的镊子插入松紧带的切口并释放镊子以打开弹性切口，使液体滴到胚胎上。注意：这确保了胚胎的补液，并且弹性膜粘附在女性的湿皮肤上，防止在接下来的步骤中PBS泄漏。 用镊子拉出对应于三个胚胎的子宫的一部分，然后轻轻地将培养皿栖息在女性的腹部。 用镊子和湿棉签，调整子宫位置和弹性，以确保弹性密封在女性的皮肤上，以防止PBS泄漏。 使用四个粘土脚固定并固定紧靠腹部上方的培养皿，减少对女性的压力以及对女性呼吸和心跳成像的敏感性。 将造型粘土圆柱体向下按压到胚胎/子宫的右侧以固定子宫（图4C）。注意：此定向说明假设针头在女性的左侧，并且女性左子宫角的胚胎暴露在外。子宫的一侧（左子宫角或右子宫角）至关重要，因为AC要么面向针头（左角; 图4D）或面向稳定粘土圆柱体（右喇叭; 图 4E）。 要从右子宫角注射胚胎，请将粘土圆柱体放在胚胎的左侧（图4F）并将加热台旋转180°（图4G）以实现正确的方向。如果针头可以移动，请根据相关设置进行调整。 将PBS添加到培养皿中，直到胚胎和子宫被PBS覆盖。 将超声探头降低到PBS中并调整小鼠/手术台，使第一个胚胎与超声探头对齐，以便于记录注射。注意：“第一”是指胚胎从卵巢到子宫颈的编号。 扫描所有三个胚胎并检查AC。按如下方式确定进样量：用超声波机测量空调的直径。如果交流直径为 ≤0.2 毫米，则注入 69 nL;如果交流直径为 >0.2 毫米和 ≤0.29 毫米，则注入 2 x 69 nL （= 138 nL）;如果交流直径> 0.29 毫米，则注入 3 x 69 nL （= 207 nL）（图 4H）。注意：先前的实验表明，在E7.515下，高达207 nL的进样体积具有良好的耐受性。当AC的相对体积增加不超过90时，可以成功注射对生存的影响最小。同窝动物或小鼠品系之间的AC大小变化很常见，可能需要进一步优化。 使用注射控制器设置注射体积。 将注射速度设置为 慢 速，注射速率为 23 nL/s。注意：不同的设备型号可能导致不同的注射力。 使用导轨系统上的主轮（x和z平面， 图4I）将针头降低到PBS中，然后在纳米注射器控制器上按 空 ，直到液体到达针尖。注意：如果针头堵塞，按 空 可以溶解堵塞和/或排出堵塞物。 将针头从 PBS 中取出并按 注射。验证是否排出了近似所需体积的一滴。 通过将纳米注射器与显微操纵器上的y平面轮移动，将针头降低到PBS中，并将其与超声探针和胚胎对齐（图4J）。注意：当针尖在超声图像上显示为亮点时，针尖完全对齐（图4K，L）。针头可以使用显微操纵器在所有三个方向上移动。 用注射角度轮调整针头角度，以确保相对于子宫壁的注射角度接近垂直。使用显微操纵器上的注射轮将针头一次性插入AC（图4J-M）。注意针尖亮度。如果针尖从超声图像中消失，请向前或向后移动超声探头以使针头重新聚焦。注意：一旦针头进入交流电内部，可以在不伤害胚胎的情况下对针头位置和焦点进行微小的修改（在~0.3毫米内调整）。不要调整针的位置超过此位置。 按 注射 （对于 207 nL，将体积设置为 69 nL 并注射三次）。注射后，再等待5-10秒，然后轻轻地将针头缩回。 图4：成功注射羊膜腔的最佳大小和方向 。 （A）子宫角，有多个E7.5蜕膜，形状像一串球体（底部），与大肠（顶部）相比。（B）抓住蜕膜之间的子宫组织（白色虚线）。避免用镊子直接挤压蜕膜（白色箭头），因为蜕膜和发育中的胚胎在这个早期阶段很脆弱，并且在过度的外力下容易被吸收。（C）女性仰卧位，蜕膜暴露在充满PBS的培养皿中，并安装在四英尺的造型粘土上。蜕膜由一块形状像圆柱体的附加造型粘土稳定。（D、 E）AC的方向受暴露的子宫角侧面的影响。如果使用来自左子宫角的蜕膜，AC 将背对粘土稳定器，并且易于接近左侧的针头 （D）。但是，如果使用右子宫角，胎盘外锥将面向针头，使接触AC（E）更加困难。因此，当注射到右子宫角时，将粘土稳定器朝向面向针头的一侧（F），并将整个加热台旋转180°（G）。（H） 根据交流大小推荐的注射量。通常，直径≤0.2 mm的腔可以注射最大69 nL。直径> 0.2 mm 和 ≤ 0.29 mm 可承受高达 2 x 69 nL （138 nL） 的体积，0.29 mm >腔可注射 3 x 69 nL （207 nL）。比例尺 = 1 mm. （I， J） 纳米注入器连接到轨道系统，可以在 x 和/或 z 平面上移动。针的角度可以用 注射角度 轮调节。（K， L）针尖（白色箭头）在超声检查中看起来最亮时与AC对齐（L）。（M）显示注射过程的超声图像，其中针尖在AC中并且对齐良好（白色箭头）。缩写：A = 羊膜;AC = 羊膜腔;ExC = 外腔;EC = 胎盘外锥。 请点击此处查看此图的大图。 将阶段移动到下一个胚胎，如果其他两个胚胎具有合适的AC尺寸，则对它们重复步骤7.22-7.26。 使用显微操纵器将超声探头和针头从PBS中取出。将针头远离操作员，以免损坏和受伤。 用镊子将第 1和第 2个胚胎轻轻推入松紧带，将它们引导回雌性的腹部。轻轻抓住与第3个胚胎相邻的组织，并将子宫拉向弹性切口的上端。用镊子轻轻拉起第4-6个胚胎，让第3个胚胎重新进入腹部。注意：此步骤可以在不更换PBS或移除培养皿的情况下完成。 根据需要重复，直到注射所有具有最佳AC的胚胎或达到时间限制。 轻轻地将胚胎/子宫推回女性的腹部。 吸出PBS并取出培养皿。如果使用了病毒，请作为传染性废物处理。 用Vicryl（USP 6-0，针长13毫米，3/8圆）在简单的连续或中断缝合中缝合肌肉层，并用1-2个夹子闭合皮肤（见 材料表）。 关闭异氟烷泵。 取下手术胶带，将女性置于俯卧位（腹部朝下）在40°C加热板上的干净笼子中。注意：预计雌性将在 10 分钟内恢复意识并移动。确保该过程在30分钟内完成。女性的遗传背景、年龄和体重可能会影响对麻醉的敏感性。在手术过程中监测小鼠呼吸缓慢（呼吸缓慢意味着麻醉太深）或运动（麻醉太轻）的迹象。丁丙诺啡（0.05-0.1毫克/千克体重）或氟尼辛（2.5毫克/千克）或类似物符合当地动物福利规定，如果需要，可在第一次注射后8小时提供。 如果要注射另一名女性，请准备手术区域，同时监测第一个女性的觉醒情况。用70%乙醇擦拭手术工具以去除任何残留的血液或组织，并在预热的玻璃珠灭菌器中消毒10秒。丢弃棉签和用过的纸巾。用薄纸擦干培养皿和粘土片。 重复步骤7.1-7.35，直到所有雌性都被注射。 清空并丢弃针头。如果针头中残留有病毒或注射液，请按纳米注射器上的 Empty 并将 针头的内容物倒在薄纸上。 按 Fill 键完全缩回金属柱塞，直到控制器发出两声蜂鸣音，表示柱塞已完全缩回。 松开夹头并将针从金属柱塞上滑下。将针头丢弃到锐器废物容器中。 清洁 BSL-2 工作台。如果使用了病毒，请用消毒剂喷洒整个手术区域（见 材料表）。15分钟后，擦去消毒剂并用70%乙醇清洁整个手术区域。如果没有使用病毒，请用70%乙醇清洁所有表面。 用干燥、柔软且不起毛的薄纸擦去超声探头上残留的任何 PBS。 根据生物安全准则丢弃废物。 关闭超声机、加热台、BSL2 工作台和 O2 电源。