نمط الكائنات الحية الدقيقة والجسيمات الدقيقة من خلال التجميع المتسلسل بمساعدة الشعيرات الدموية
Summary
نحن نقدم تقنية تستخدم التجميع بمساعدة الشعيرات الدموية في منصة الموائع الدقيقة لنمط الأجسام الصغيرة الحجم المعلقة في سائل ، مثل البكتيريا والغرويات ، في صفائف موصوفة على ركيزة polydimethylsiloxane.
Abstract
يوفر النمذجة الخاضعة للرقابة للكائنات الحية الدقيقة في ترتيبات مكانية محددة إمكانيات فريدة لمجموعة واسعة من التطبيقات البيولوجية ، بما في ذلك دراسات علم وظائف الأعضاء الميكروبية والتفاعلات. وعلى أبسط مستوى، من شأن الأنماط المكانية الدقيقة للكائنات الحية الدقيقة أن تمكن من التصوير الموثوق به والطويل الأجل لأعداد كبيرة من الخلايا الفردية وتحويل القدرة على الدراسة الكمية للتفاعلات بين الميكروبات والميكروبات المعتمدة على المسافة. وعلى نحو أكثر تفردا، فإن الاقتران بين الأنماط المكانية الدقيقة والتحكم الكامل في الظروف البيئية، على النحو الذي توفره تكنولوجيا الموائع الدقيقة، من شأنه أن يوفر منصة قوية ومتعددة الاستخدامات للدراسات أحادية الخلية في علم البيئة الميكروبي.
تقدم هذه الورقة منصة الموائع الدقيقة لإنتاج أنماط متعددة الاستخدامات ومحددة من قبل المستخدم للكائنات الحية الدقيقة داخل قناة الموائع الدقيقة ، مما يسمح بالوصول البصري الكامل للمراقبة طويلة الأجل عالية الإنتاجية. تعتمد تقنية الموائع الدقيقة الجديدة هذه على تجميع الجسيمات بمساعدة الشعيرات الدموية وتستغل القوى الشعرية الناشئة عن الحركة الخاضعة للرقابة لتعليق التبخر داخل قناة الموائع الدقيقة لإيداع كائنات فردية صغيرة الحجم في مجموعة من الفخاخ المصنعة على ركيزة متعددة الميثيل سيلوكسان (PDMS). تولد الترسبات المتسلسلة التخطيط المكاني المطلوب لأنواع مفردة أو متعددة من الكائنات صغيرة الحجم ، تمليها فقط هندسة الفخاخ وتسلسل التعبئة.
تمت معايرة المنصة باستخدام جزيئات غروية ذات أبعاد ومواد مختلفة: فقد أثبتت أنها أداة قوية لتوليد أنماط غروية متنوعة وإجراء عملية سطحية للجسيمات المحاصرة. علاوة على ذلك ، تم اختبار المنصة على الخلايا الميكروبية ، باستخدام خلايا الإشريكية القولونية كبكتيريا نموذجية . تم نقش الآلاف من الخلايا الفردية على السطح ، وتم رصد نموها بمرور الوقت. في هذه المنصة ، يسمح اقتران ترسب الخلية الواحدة وتكنولوجيا الموائع الدقيقة بكل من الأنماط الهندسية للكائنات الحية الدقيقة والتحكم الدقيق في الظروف البيئية. وبالتالي فإنه يفتح نافذة على فسيولوجيا الميكروبات المفردة وبيئة التفاعلات بين الميكروبات والميكروبات ، كما هو موضح في التجارب الأولية.
Introduction
إن الأنماط المكانية للكائنات الحية الدقيقة المفردة ، خاصة داخل الساحات التجريبية التي تمكن من التحكم الكامل في الظروف البيئية ، مثل أجهزة الموائع الدقيقة ، أمر مرغوب فيه للغاية في مجموعة واسعة من السياقات. على سبيل المثال، فإن ترتيب الكائنات الحية الدقيقة في صفائف منتظمة من شأنه أن يسمح بالتصوير الدقيق لأعداد كبيرة من الخلايا الفردية ودراسة نموها، وعلم وظائف الأعضاء، والتعبير الجيني استجابة للمحفزات البيئية، وقابلية الأدوية. كما سيسمح بدراسة التفاعلات بين الخلايا والخلايا ذات الأهمية الخاصة في البحوث في مجال الاتصالات الخلوية (على سبيل المثال، استشعار النصاب)، أو التغذية المتقاطعة (على سبيل المثال، التكافل بين الطحالب والبكتيريا)، أو العداء (على سبيل المثال، اعتلال الأليلو)، مع السيطرة الكاملة على التوطين المكاني للخلايا بالنسبة لبعضها البعض. تعد دراسات فسيولوجيا الخلية وتطورها1، ودراسات التفاعل بين الخلايا والخلايا2، وفحص التمايز الظاهري3، والرصد البيئي4، وفحص الأدوية5 من بين المجالات التي يمكن أن تستفيد بشكل كبير من التكنولوجيا القادرة على تحقيق مثل هذا التحليل الكمي أحادي الخلية.
تم اقتراح العديد من الاستراتيجيات لعزل الخلايا المفردة والتعامل معها في السنوات الأخيرة ، من الفخاخ البصرية ثلاثية الأبعاد 6 وطرق تشغيل السطح غير المتجانسة 7،8،9،10 إلى الكيموزتات أحادية الخلية 11 والموائع الدقيقة القطيرات 12. هذه الطرق إما صعبة للغاية من الناحية الفنية أو تؤثر على فسيولوجيا الخلية وتفشل في توفير منصة عالية الإنتاجية لنمط الميكروبات التي يمكن دراستها على مدى فترات طويلة ، مما يضمن دقة الخلية الواحدة ، والوصول البصري الكامل ، والتحكم في الظروف البيئية. الهدف من هذه الورقة هو وصف منصة لنمط البكتيريا بدقة ميكرومترية في ترتيبات مكانية محددة على سطح PDMS من خلال التجميع بمساعدة الشعيرات الدموية. تسمح هذه المنصة بنمط مكاني دقيق ومرن للميكروبات وتمكن من الوصول البصري الكامل والتحكم في الظروف البيئية ، وذلك بفضل طبيعتها الموائع الدقيقة.
التكنولوجيا الكامنة وراء هذه المنصة هي تقنية تجميع تم تطويرها في السنوات الأخيرة ، تسمى sCAPA13,14,15 (تجميع الجسيمات بمساعدة الشعيرات الدموية التسلسلية) التي تم دمجها في منصة الموائع الدقيقة 16. الغضروف المفصلي لقطرة سائلة متبخرة ، أثناء انحسارها فوق ركيزة منقوشة من polydimethylsiloxane (PDMS) داخل قناة ميكروفلويدية ، تمارس قوى شعرية تحبس الجسيمات الغروية الفردية المعلقة في السائل في آبار ميكرومترية دقيقة الصنع على الركيزة (الشكل 1A). يتم نقل الجسيمات العالقة أولا إلى واجهة الهواء السائل بواسطة تيارات الحمل الحراري ثم توضع في الفخاخ بواسطة الشعيرات الدموية. تعمل القوى الشعرية التي يمارسها الغضروف المفصلي المتحرك على نطاق أوسع مقارنة بالقوى المشاركة في تفاعلات الجسيمات.
وبالتالي ، لا تتأثر آلية التجميع بالمواد والأبعاد والخصائص السطحية للجسيمات. المعلمات مثل تركيز الجسيمات ، وسرعة الغضروف المفصلي ، ودرجة الحرارة ، والتوتر السطحي للتعليق هي المعلمات الوحيدة التي تؤثر على عائد عملية النقش. يمكن للقارئ العثور على وصف مفصل لتأثير المعلمات المذكورة أعلاه على عملية النقش في13،14،15. في تقنية sCAPA الأصلية13،14،15 ، تم تنفيذ عملية النقش الغروي في نظام مفتوح وتطلب مرحلة كهرضغطية عالية الدقة لدفع التعليق عبر القالب. تستغل هذه المنصة استراتيجية مختلفة وتسمح بإجراء النقش باستخدام المعدات القياسية المستخدمة بشكل عام في الموائع الدقيقة في بيئة خاضعة للرقابة ، وبالتالي تقليل مخاطر تلويث العينات.
تم تحسين هذه المنصة الموائع الدقيقة لأول مرة على الجسيمات الغروية لإنشاء صفائف منتظمة من الجسيمات الخاملة ثم تطبيقها بنجاح على البكتيريا. تم وصف كل من منصات الموائع الدقيقة في هذه الورقة (الشكل 1B ، C). ومعظم الخطوات التحضيرية والمعدات التجريبية الموصوفة في البروتوكول شائعة في التطبيقين (الشكل 2). نقوم بالإبلاغ عن الأنماط الغروية لإثبات أنه يمكن استخدام هذه التقنية لإجراء ترسبات متسلسلة متعددة على نفس السطح لإنشاء أنماط معقدة ومتعددة المواد. على وجه الخصوص ، تم إيداع جسيم واحد لكل فخ لكل خطوة لتشكيل صفائف غروية ذات هندسة وتكوين محددين ، تمليهما فقط هندسة الفخاخ وتسلسل التعبئة. أما بالنسبة للأنماط البكتيرية ، يتم وصف الترسبات الفردية ، مما يؤدي إلى ترسب بكتيريا واحدة لكل فخ. بمجرد أن يتم نقش الخلايا على السطح ، يتم مسح قناة الموائع الدقيقة بوسط لتعزيز نمو البكتيريا ، وهي الخطوة الأولية لأي دراسة أحادية الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تسمح منصة الموائع الدقيقة الموصوفة هنا بنقش الأجسام الصغيرة الحجم ، مثل الغرويات والبكتيريا ، في ترتيبات مكانية موصوفة على ركيزة PDMS. إن التحكم الكامل في الظروف البيئية التي توفرها الموائع الدقيقة والقدرة على نمط الخلايا بدقة ميكرومترية تمنحها تقنية sCAPA يجعلها منصة واعدة للغاية لدراسات ع…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف المؤلفون بالدعم المقدم من منحة SNSF PRIMA 179834 (إلى E.S.) ، ومنحة أبحاث ETH ETH-15 17-1 (R. S.) ، وجائزة جوردون وبيتي مور للباحث في التكافل الميكروبي المائي (منحة GBMF9197) (R. S.). يشكر المؤلفون الدكتور ميغيل أنخيل فرنانديز رودريغيز (جامعة غرناطة ، إسبانيا) على تصوير SEM للبكتيريا وعلى المناقشات الثاقبة. يشكر المؤلفون الدكتورة جين نغوين (جامعة كولومبيا البريطانية ، كندا) ، والدكتورة لورا ألفاريز (ETH Zürich ، سويسرا) ، وكاميرون بوغون (ETH Zürich ، سويسرا) والدكتور فابيو غريلو على المناقشات الثاقبة.
Materials
| Alcatel AMS 200SE I-Speeder | Alcatel Micro Machining System | deep reactive ion exchange system | |
| Alconox | detergent | ||
| AZ400K developer | MicroChemicals | AZ400K | |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to ensure a uniform and constant temperature in the channel | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | used to replace the overnight media with fresh minimal media |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi267 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi182 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi183 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi180 | |
| Gigabatch 310 M | PVA TePla | used to plasma treat a 10 cm silicon wafer | |
| H401-T-CONTROLLER | Okolab | controller of the heated glass plate | |
| H601-NIKON-TS2R-GLASS | Okolab | heated glass plate | |
| Heidelberg DWL 2000 | Heidelberg Instruments | UV direct laser writer | |
| Insulin syringes, U 100, with luer | Codan Medical ApS | CODA621640 | 1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process |
| Klayout | Opensource | used to design the features on the silicon master | |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244610 | Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| MOPS (10x) | Teknova | M2101 | diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | microscope | |
| openSCAD | Opensource | used to design the mold | |
| OPTIspin SB20 | ATM group | 51-0002-01-00 | spin developer |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma treat the template and microchannel to bond them |
| Positive photoresist AZ1505 | MicroChemicals | AZ1505 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | added to MOPS 1x |
| Prusa curing and Washing machine CW1S | Prusa | used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold | |
| Prusa Resin – Tough | Prusa Research a.s. | UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing | |
| Prusa SL1 3d printer | Prusa | used to print the mold | |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weight PDMS mixture |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N/Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | chromium etchant | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | 448931 | used to silianize the 3D printed mold |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P1379 | used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | profilometer | |
| VTC-100 Vacuum Spin Coater | MTI corporation | vacuum spin coater |
Referencias
- Choi, C. H., et al. Preparation of bacteria microarray using selective patterning of polyelectrolyte multilayer and poly(ethylene glycol)-poly(lactide) deblock copolymer. Macromolecular Research. 18 (3), 254-259 (2010).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1576-1581 (2016).
- Thomas, C. M., Nielsen, K. M. Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria. Nature Reviews Microbiology. 3 (9), 711-721 (2005).
- Suo, Z., Avci, R., Yang, X., Pascual, D. W. Efficient Immobilization and patterning of live bacterial cells. Langmuir. 24 (8), 4161-4167 (2008).
- Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Analytical Chemistry. 78 (13), 4291-4298 (2006).
- Akselrod, G. M., et al. Laser-guided assembly of heterotypic three-dimensional living cell microarrays. Biophysical Journal. 91 (9), 3465-3473 (2006).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C., Dague, E. Nanomechanical properties of dead or alive single-patterned bacteria. Langmuir. 25 (10), 5731-5736 (2009).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C. Controlled assembly of bacteria on chemical patterns using soft lithography. Colloids and Surfaces: B Biointerfaces. 65 (2), 285-291 (2008).
- Rozhok, S., et al. Attachment of motile bacterial cells to prealigned holed microarrays. Langmuir. 22 (26), 11251-11254 (2006).
- Xu, L., et al. Microcontact printing of living bacteria arrays with cellular resolution. Nano Letters. 7 (7), 2068-2072 (2007).
- Ingham, C. J., et al. The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18217-18222 (2007).
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Ni, S., Isa, L., Wolf, H. Capillary assembly as a tool for the heterogeneous integration of micro- and nanoscale objects. Soft Matter. 14 (16), 2978-2995 (2018).
- Ni, S., Leemann, J., Buttinoni, I., Isa, L., Wolf, H. Programmable colloidal molecules from sequential capillarity-assisted particle assembly. Science Advances. 2 (4), 1501779 (2016).
- Ni, S., Leemann, J., Wolf, H., Isa, L. Nanoparticle Insights into mechanisms of capillary assembly. Faraday Discussions. 181, 225-242 (2014).
- Pioli, R., et al. Sequential capillarity-assisted particle assembly in a microfluidic channel. Lab on a Chip. 21 (5), 888-895 (2021).
- Geissler, M., et al. Fabrication of metal nanowires using microcontact printing. Langmuir. 19 (15), 6301-6311 (2003).
- Wang, Y., et al. Systematic prevention of bubble formation and accumulation for long-term culture of pancreatic islet cells in microfluidic device. Biomedical Microdevices. 14 (2), 419-426 (2012).
- Crowley, L. C., et al. Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 647-651 (2016).
