T 세포 면역 시냅스의 미립자 출력을 연구하기 위해 비드 지원 지질 이중층의 준비

면역학적 시냅스(IS)는 병트라크 정보의 조절된 교환을 용이하게 하는 물리적 접촉에 종사하는 세포의 인터페이스에서 형성된 중추적인 분자 구조이다. 다른 IS는 문헌에 기술되었습니다, 증거의 성장 몸은 이 분자 허브가 세포 네트워크의 보존 된 기능임을 시사한다. B 세포, 자연 킬러 세포, 수지상 세포, 대식세포 및 T 세포를 포함한 다양한 면역 세포는 단명 한 접촉1의 ^{조립을 통해} 정보를 교환합니다. 다세포 연구는 병원성 세포 네트워크를 운전하고 알 수없는 기능을 가진 표면 단백질을 표현하는 백혈구와 기질 세포의 새로운 하위 집합에 대한 이해를 발전시키고 있습니다. 합성 APC로서, BSLB는 신호, 즉 항원 및 비용 절전/코어 프레스의 통합에서 개별 단백질의 기능적 역할에 대한 직접적인 조사를 허용하고, T 세포및 신호 4라고 하는 이펙터 입자의 결과 방출을 허용한다.

이 문서에서는 BSLB를 사용하여 모델 APC의 표면 구성을 모방하는 동안 고려해야 할 프로토콜 및 중요한 기술 포인트를 설명합니다. APC에 면역 수용체 및 기타 표면 단백질의 정량적 측정을 위한 프로토콜은 이러한 측정된 양을 포함하는 합성 APC의 재구성을 위한 프로토콜과 함께 제시된다. 이어서, T 세포와 BSLB를 응모하는 데 필요한 단계는 유동 세포측정법을 사용하여 트랜스 시냅스 입자 전달의 정량적 측정을 위한 프로토콜과 함께 제시된다. 가장 놀랍게도, BSLBs는 시냅스 ectosomes (SEs)라고 불리는 tSV의 플라즈마 막 유래 인구를 연구하는 것을 용이하게합니다. T 세포 항원 수용체 농축(TCR⁺) SEs는 TCR 트리거^ing2에 반응하여 창고되고 BSLBs3에 의해 효율적으로 포획되며, 이는 항원 및 모델링된 멤브레인 조성물의 작용특성을 평가하기 위한 우수한 판독을 나타낸다. CD63⁺ 엑소좀 및 수퍼분자 공격 입자(SMAP)는 또한 자극된 T 세포에 의해 방출되고 BSLBs에 의해 포획된다. 그(것)들은 T 세포에 의하여 활성화 및 결과 엑소세포 및 lytic 과립 분비의 추가 판독으로 이용될 수 있습니다. T 세포의 상호작용극에 외세포 소포의 동원은 또한 활성화에 대한 응답으로 IL-2, IFN-γ 및 IL-10과 같은 사이토카인의 방향 방출을 용이하게 한다4,5,6,7,8. T 세포 방출 된 사이토카인은 또한 BSLBs에서 검출될 수 있더라도, 면역학적 시냅스에서 사이토카인 방출의 정량적 분석을 검증하기 위하여 더 헌신적인 연구 결과는 현재 개발되고 있습니다.

특정 멤브레인 조성이 T 세포의 시냅스 출력에 미치는 영향을 심문하려면 표적 멤브레인 성분의 생리적 밀도를 정의해야 합니다. 세포 표면 단백질의 유동 세포측정 기반 정량화는 이 프로토콜에서 필수적인 단계이며, 항체당 불소크롬의 알려진 수(F/P) 및 2) 벤치마크 비드의 사용은 측정된 평균 형광 성소 인텐션(MFIs)에서 형광 분자를 보간하는 표준 기준을 제공한다.

이러한 벤치마크 표준은 5개의 구슬 모집단으로 구성되며, 각각 임의형 광채 검출의 동적 범위에 걸쳐 있는 동등한 용해성 형광(MESFs)의 수가 증가하고 있습니다. 이러한 표준 인구는 간단한 선형 회귀에 의해 임의형형 단위를 MESF로 변환하는 것을 용이하게 하는 이산 형광 피크를 산출합니다. 결과 MESFs는 그 때 세포 당 결합된 분자의 평균 수를 계산하기 위하여 항체 F/P 값과 함께 이용됩니다 (또는 나중에 단계에서 BSLB). 검출된 분자의 평균 수에 추정된 세포 표면 영역의 응용은 분자/^μm2로 생리적 밀도의 계산을 가능하게 합니다. 이러한 정량화 프로토콜은 또한 T 세포에 대한 단백질 밀도 의 측정및 동종성 T 세포 시냅스의 형성을 중재하는 막 조성물의 생화학적 재구성(즉, T-T 시냅스⁹)에 적응될 수 있다. 필요한 경우, 항체 결합의 valency는 분자 당 불소크롬의 알려진 숫자로 표지된 재조합 표적을 사용하여 더 추정될 수 있습니다. 이어서, 항체 결합 발렛은 결합형 형광 단백질및 정량화 항체의 수를 동시에 비교하여 동일한 BSLB 집단에 대해 계산될 수 있다(2개의 상이한 정량화 형광 및 MESF 표준을 사용).

APC 멤브레인의 재구성은 실리카 구슬¹에 지원되는 지질 양층(SLBs)의 조립이 필요합니다. 상이한 인지질종을 함유하는 리포솜 스톡은 다재다능한 지질 이중층 매트릭스를 형성하기 위해 활용될 수 있으며, 상이한 결합 화학을 이용한 재조합 단백질의 고정을 가능하게 한다(리포솜의 제조는 ¹⁰에서 상세하다). 관련 리간드의 생리밀도(또는 밀도)가 정의되면, 동일한 유동 세포측정 프로토콜은 표적 생리밀도로 BSLB를 코팅하는 데 필요한 재조합 단백질의 농도를 추정하도록 조정된다. 두 개의 서로 다른 앵커링 시스템을 조합하거나 별도로 사용할 수 있습니다.

첫째, ^Ni2+함유 인지질의 최종 12.5 mol%를 함유하는 SLB는 평방 마이크로란¹⁰ 당 약 10,000개의 그의 태그 결합 부위를 제공하기에 충분하며, 생리학적 밀도가 최대 적재 용량을 초과하지 않는 대부분의 상업적으로 이용 가능한 단백질로 BSLB를 장식하는 데 효과적입니다. 두 번째 로딩 시스템은 스테렙타비딘 다리를 통해 바이오티닝 방지 CD3e Fab(또는 HLA/MHC 모노머)을 적재하기 위해 비오틴 함유 인지질(mol%)을 이용합니다. 이러한 두 가지 BSLB 장식 방법의 조합은 합성 APC로 BSLBs의 유연한 테일러링을 가능하게합니다. 매우 복잡한 APC 표면 조성물의 경우, 인지질및 단백질의 몰%는 당면한 질문만큼 많은 단백질을 적재하도록 증가시킬 수 있다. 단백질의 작동 농도와 바이오타이니지의 몰%가 정의되면, BSLB는 다중 파라메트릭 유동 세포측정을 사용하여 T 세포의 시냅스 출력을 심문하기 위해 조립될 수 있다.