Voorbereiding van door kralen ondersteunde lipide bilayers om de deeltjesoutput van T-cel immuunsynapsen te bestuderen

De immunologische synaps (IS) is een cruciale moleculaire structuur gevormd op het grensvlak van cellen die betrokken zijn bij fysiek contact dat de gereguleerde uitwisseling van juxtracrine-informatie vergemakkelijkt. Verschillende ES’en zijn beschreven in de literatuur, en een groeiend aantal bewijzen suggereert dat deze moleculaire hubs een geconserveerd kenmerk zijn van cellulaire netwerken. Verschillende immuuncellen, waaronder B-cellen, natural killer-cellen, dendritische cellen, macrofagen en T-cellen, wisselen informatie uit via de assemblage van kortstondige ^contacten1. Multiomische studies bevorderen het begrip van nieuwe subsets van leukocyten en stromale cellen die pathogene cellulaire netwerken aandrijven en oppervlakte-eiwitten met onbekende functies tot expressie brengen. Als synthetische APC’s maken BSLBs het mogelijk om direct onderzoek te doen naar de functionele rol van individuele eiwitten bij de integratie van activerende signalen, namelijk antigenen en costimulatie/corepressie, door T-cellen en de resulterende afgifte van effectordeeltjes die signaal vier worden genoemd.

Dit artikel beschrijft de protocollen en kritieke technische punten waarmee rekening moet worden gehouden bij het gebruik van BSLBs om de oppervlaktesamenstelling van model-APC’s na te bootsen. De protocollen voor de kwantitatieve meting van immuunreceptoren en andere oppervlakte-eiwitten op APC’s worden gepresenteerd samen met het protocol voor de reconstitutie van synthetische APC’s die deze gemeten hoeveelheden bevatten. Vervolgens worden de stappen die nodig zijn voor het cocultureren van T-cellen en BSLB gepresenteerd, samen met het protocol voor de kwantitatieve meting van trans-synaptische deeltjesoverdracht met behulp van flowcytometrie. Het meest opmerkelijke is dat BSLBs het bestuderen van een plasmamembraan-afgeleide populatie van tSV’s genaamd synaptische ectosomen (SE’s) vergemakkelijken. T-cel antigeenreceptorverrijkte (TCR⁺) SE’s worden afgestoten als reactie op TCR-triggering2 en efficiënt opgevangen door BSLBs3, wat een uitstekende uitlezing vertegenwoordigt om de agonistische eigenschappen van antigenen en de gemodelleerde membraansamenstelling te beoordelen. CD63⁺ exosomen en supramoleculaire aanvalsdeeltjes (SMAPs) worden ook vrijgegeven door gestimuleerde T-cellen en opgevangen door BSLBs. Ze kunnen worden gebruikt als extra uitlezingen van activering en de resulterende exocytische en lytische korrelsecretie door T-cellen. De mobilisatie van exocytische blaasjes naar de interagerende pool van de T-cel vergemakkelijkt ook de directionele afgifte van cytokines, zoals IL-2, IFN-γ en IL-10 als reactie op activering4,5,6,7,8. Hoewel T-cel vrijgegeven cytokines ook kunnen worden gedetecteerd op BSLBs, is er momenteel een meer toegewijde studie in ontwikkeling om de kwantitatieve analyse van cytokine-afgifte bij de immunologische synaps te valideren.

Om te onderzoeken hoe specifieke membraansamenstellingen de synaptische output van T-cellen beïnvloeden, moet de fysiologische dichtheid van de doelmembraancomponent worden gedefinieerd. Op flowcytometrie gebaseerde kwantificeringen van celoppervlakeiwitten zijn een essentiële stap in dit protocol en vereisen: 1) het gebruik van antilichamen met bekende aantallen fluorochchromen per antilichaam (F / P), en 2) benchmarkparels die een standaardreferentie bieden voor het interpoleren van fluorochroommoleculen uit gemeten gemiddelde fluorescentie-intensiteiten (MFI’s).

Deze benchmarkstandaarden bestaan uit vijf kralenpopulaties, die elk een toenemend aantal equivalent oplosbare fluorochchromen (MESF’s) bevatten, die het dynamische bereik van willekeurige fluorescentiedetectie overspannen. Deze standaardpopulaties leveren discrete fluorescentiepieken op, waardoor de omzetting van willekeurige fluorescentie-eenheden in MESF’s door eenvoudige lineaire regressie wordt vergemakkelijkt. De resulterende MESF’s worden vervolgens gebruikt naast antilichaam F / P-waarden om het gemiddelde aantal gebonden moleculen per cel (of BSLB in latere stappen) te berekenen. De toepassing van geschatte celoppervlakken op het gemiddelde aantal gedetecteerde moleculen maakt vervolgens de berekening van fysiologische dichtheden als moleculen/^{μm2 mogelijk}. Dit kwantificeringsprotocol kan ook worden aangepast aan de meting van eiwitdichtheden op T-cellen en de biochemische reconstitutie van membraansamenstellingen die de vorming van homotypische T-cel synapsen (d.w.z. T-T-synapsen9) bemiddelen. Indien nodig kan de valentie van antilichaambinding verder worden geschat door recombinante doelen te gebruiken die zijn gelabeld met bekende aantallen fluorochromen per molecuul. Vervolgens kan de antilichaambindende valentie voor dezelfde BSLB-populatie worden berekend door tegelijkertijd het aantal gebonden fluorescerende eiwitten en kwantificeringsantistoffen te vergelijken (met behulp van twee verschillende kwantificeringsfluorocchromen en MESF-normen).

De reconstitutie van APC-membranen vereist de assemblage van ondersteunde lipide bilayers (SLBs) op ^{silicakorrels1}. Liposoomvoorraden die verschillende fosfolipidesoorten bevatten, kunnen worden gebruikt om een veelzijdige lipide-dubbellaagsmatrix te vormen, waardoor recombinante eiwitten met verschillende bindingschemie kunnen worden verankerd (de bereiding van liposomen wordt beschreven in ¹⁰). Zodra de fysiologische dichtheid (of dichtheden) van het relevante ligand “op cellen” is gedefinieerd, wordt hetzelfde flowcytometrieprotocol aangepast om de concentratie van recombinant eiwit te schatten die nodig is om BSLBs te coaten met de beoogde fysiologische dichtheid. Twee verschillende verankeringssystemen kunnen in combinatie of afzonderlijk worden gebruikt.

Ten eerste is SLB met een laatste 12,5 mol% ^Ni2+-bevattende fosfolipiden voldoende om ongeveer 10.000 His-tag bindingsplaatsen per vierkante ^micron10 te leveren en werkt het goed om BSLBs te versieren met de meeste in de handel verkrijgbare eiwitten waarvan de fysiologische dichtheden deze maximale laadcapaciteit niet overschrijden. Het tweede laadsysteem maakt gebruik van biotinebevattende fosfolipiden (als mol%) om gebiotinyleerde anti-CD3e Fab (of HLA/MHC-monomeren) te laden via streptavidinbruggen. De combinatie van deze twee BSLB-decoratiemethoden maakt vervolgens de flexibele afstemming van BSLBs als synthetische APC’s mogelijk. Voor zeer complexe APC-oppervlaktesamenstellingen kan de mol% van fosfolipiden en eiwitten worden verhoogd om zoveel eiwitten te laden als de vraag vereist. Zodra de werkconcentraties van eiwitten en mol% van gebiotinyleerde fosfolipiden zijn gedefinieerd, kunnen BSLBs worden geassembleerd om de synaptische output van T-cellen te ondervragen met multiparametrische flowcytometrie.