Количественная оценка сосудистых параметров у целых сетчаток мышей с непролиферативными и пролиферативными ретинопатиями
Summary
В данной статье описан хорошо зарекомендовавший себя и воспроизводимый анализ лектиновых пятен для всего препарата сетчатки и протоколы, необходимые для количественного измерения сосудистых параметров, часто изменяющихся при пролиферативных и непролиферативных ретинопатиях.
Abstract
Ретинопатии представляют собой гетерогенную группу заболеваний, которые поражают нейросенсорную ткань глаза. Для них характерны нейродегенерация, глиоз и прогрессирующее изменение сосудистой функции и структуры. Хотя начало ретинопатий характеризуется тонкими нарушениями зрительного восприятия, модификации в сосудистом сплетении являются первыми признаками, обнаруженными клиницистами. Отсутствие или наличие неоваскуляризации определяет, классифицируется ли ретинопатия как непролиферативная (NPDR) или пролиферативная (PDR). В этом смысле несколько животных моделей пытались имитировать специфические сосудистые особенности каждой стадии, чтобы определить основные механизмы, участвующие в изменениях эндотелия, гибели нейронов и других событиях, происходящих в сетчатке. В этой статье мы предоставим полное описание процедур, необходимых для измерения сосудистых параметров сетчатки у взрослых и мышей с ранними родами на послеродовой день (P)17. Мы подробно расскажем о протоколах проведения окрашивания сосудов сетчатки изолектином GSA-IB4 в целых креплениях для последующей микроскопической визуализации. Также предусмотрены ключевые этапы обработки изображений с помощью программного обеспечения Image J Fiji, поэтому считыватели смогут измерять плотность сосудов, диаметр и извилистость сосудов, ветвление сосудов, а также аваскулярные и неоваскулярные области. Эти инструменты очень полезны для оценки и количественной оценки сосудистых изменений как при непролиферативных, так и при пролиферативных ретинопатиях.
Introduction
Глаза питаются двумя артерио-венозными системами: сосудисто-сосудистой, внешней сосудистой сетью, орошающей пигментированный эпителий сетчатки и фоторецепторы; и сосудисто-нервно-ретинальные сосуды, которые орошают слой ганглиозных клеток и внутренний ядерный слой сетчатки1. Сосудистая система сетчатки представляет собой организованную сеть сосудов, которые доставляют питательные вещества и кислород к клеткам сетчатки и собирают отходы для обеспечения надлежащей визуальной сигнальной трансдукции. Эта сосудистая система имеет некоторые отличительные особенности, в том числе: отсутствие автономной иннервации, регуляция сосудистого тонуса внутренними механизмами сетчатки и наличие сложного сетчаточно-гематоэнцефалического барьера2. Поэтому сосудистая система сетчатки была в центре внимания многих исследователей, которые широко изучали не только васкулогенез во время развития, но и изменения и патологический ангиогенез, которым подвергаются эти сосуды при заболеваниях3. Наиболее распространенными сосудистыми изменениями, наблюдаемыми при ретинопатиях, являются дилатация сосудов, неоваскуляризация, потеря сосудистой арборизации и деформация магистральных сосудов сетчатки, что делает их более зигзагообразными4,5,6. Одно или несколько из описанных изменений являются самыми ранними признаками, которые будут обнаружены клиницистами. Визуализация сосудов обеспечивает быстрый, неинвазивный и недорогой метод скрининга7. Обширное изучение изменений, наблюдаемых в сосудистом дереве, определит, является ли ретинопатия непролиферативной или пролиферативной, и дальнейшее лечение. Непролиферативные ретинопатии могут проявляться аберрантной морфологией сосудов, снижением плотности сосудов, бесклеточными капиллярами, гибелью перицитов, макулярным отеком и др. Кроме того, пролиферативные ретинопатии также развивают повышенную проницаемость сосудов, внеклеточное ремоделирование и образование сосудистых пучков к полости стекловидного тела, которые легко разрушаются или индуцируют отслоение сетчатки8.
После обнаружения ретинопатию можно контролировать через ее сосудистые изменения9,10. За прогрессированием патологии можно следить через структурные изменения сосудов, которые четко определяют стадии заболевания11. Количественная оценка сосудистых изменений в этих моделях позволила соотнести изменения сосудов и гибель нейронов и протестировать фармакологическую терапию для пациентов в разных фазах заболевания.
В свете вышеуказанных утверждений мы считаем, что распознавание и количественная оценка сосудистых изменений являются фундаментальными в исследованиях ретинопатий. В этой работе мы покажем, как измерять различные сосудистые параметры. Для этого мы будем использовать две модели животных. Одним из них является модель мышиной ретинопатии, индуцированная кислородом12, которая имитирует ретинопатию недоношенных и некоторые аспекты пролиферативной диабетической ретинопатии13,14. В этой модели мы будем измерять аваскулярные области, неоваскулярные области, а также дилатацию и извилистость магистральных сосудов. В нашей лаборатории была разработана модель мыши метаболического синдрома (MetS), которая индуцирует непролиферативную ретинопатию15. Здесь мы оценим плотность сосудов и ветвление.
Protocol
Representative Results
Discussion
Животные модели ретинопатий являются мощными инструментами для изучения развития сосудов, ремоделирования или патологического ангиогенеза. Успех этих исследований в этой области зависит от легкого доступа к тканям, что позволяет выполнять широкий спектр методов, предоставляя данны?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Карлоса Маса, Марию Пилар Креспо и Сесилию Сампедро из CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Кордова, Аргентина) за помощь в конфокальной микроскопии, Соледад Миро и Викторию Бланко за специализированный уход за животными и Лауру Гатику за гистологическую помощь. Мы также благодарим Виктора Диаса (просекретаря по институциональной коммуникации FCQ) за производство и издание видео и Пола Хобсона за его критическое чтение и языковой пересмотр рукописи.
Эта статья финансировалась за счет грантов Секретариата по вопросам науки и технологии, Национального университета Кордовы (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Фонда научных исследований и технологий (FONCyT), Проекта исследований в области науки и технологии (PICT) 2015 N° 1314 (все до M.C.S.).
Materials
| Aluminuim foil | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A4503 | quality |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | C3306 | |
| Hydrochloric acid | Biopack | 9632.08 | |
| Confocal Microscope FV1200 | Olympus | FV1200 | with motorized plate |
| Covers | Paul Marienfeld GmnH & Co. | 111520 | |
| Dissecting Microscope | NIKON | SMZ645 | |
| Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate | Merck | 119753 | |
| 200 µL tube | Merck | Z316121 | |
| Filter paper | Merck | WHA5201090 | |
| Incubator shaker GyroMini | LabNet International | S0500 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | I21411 | |
| Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88) | Merck | 475904 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 158127 | |
| pHmeter | SANXIN | PHS-3D-03 | |
| Potassium chloride | Merck | P9541 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 1,04,873 | |
| Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sodium chloride | Merck | S3014 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S5881 | |
| Tris | Merck | GE17-1321-01 | |
| Triton X-100 | Merck | X100-1GA | |
| Vessel Analysis Fiji software | Mai Elfarnawany | https://imagej.net/Vessel_Analysis |
Referencias
- Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).
- McDougal, D. H., Gamlin, P. D. Autonomic control of the eye. Comprehensive Physiology. 5 (1), 439-473 (2015).
- Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
- Wei, Y., et al. Age-related alterations in the retinal microvasculature, microcirculation, and microstructure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (9), 3804-3817 (2017).
- Lavia, C., et al. Reduced vessel density in the superficial and deep plexuses in diabetic retinopathy is associated with structural changes in corresponding retinal layers. PLoS One. 14 (7), 0219164 (2019).
- Rosenblatt, T. R., et al. Key factors in a rigorous longitudinal image-based assessment of retinopathy of prematurity. Scientific Reports. 11 (1), 5369 (2021).
- Edwards, A. L. Funduscopic examination of patients with diabetes who are admitted to hospital. Canadian Medical Association Journal. 134 (11), 1263-1265 (1986).
- Lechner, J., O’Leary, O. E., Stitt, A. W. The pathology associated with diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 7-14 (2017).
- Sun, Z., et al. angiography metrics predict progression of diabetic retinopathy and development of diabetic macular edema: A prospective study. Ophthalmology. 126 (12), 1675-1684 (2019).
- Jia, Y., et al. Quantitative optical coherence tomography angiography of vascular abnormalities in the living human eye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 2395-2402 (2015).
- Pauleikhoff, D., Gunnemann, F., Book, M., Rothaus, K. Progression of vascular changes in macular telangiectasia type 2: comparison between SD-OCT and OCT angiography. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (7), 1381-1392 (2019).
- Gammons, M. V., Bates, D. O. Models of oxygen induced retinopathy in rodents. Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
- Han, N., Xu, H., Yu, N., Wu, Y., Yu, L. MiR-203a-3p inhibits retinal angiogenesis and alleviates proliferative diabetic retinopathy in oxygen-induced retinopathy (OIR) rat model via targeting VEGFA and HIF-1α. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 47 (1), 85-94 (2020).
- Paz, M. C., et al. Metabolic syndrome triggered by fructose diet impairs neuronal function and vascular integrity in ApoE-KO mouse retinas: Implications of autophagy deficient activation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 573987 (2020).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
- Zarb, Y., et al. Ossified blood vessels in primary familial brain calcification elicit a neurotoxic astrocyte response. Brain. 142 (4), 885-902 (2019).
- Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
- Subirada, P. V., et al. Effect of autophagy modulators on vascular, glial, and neuronal alterations in the oxygen-induced retinopathy mouse model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 279 (2019).
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
- Kim, C. B., D’Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
- Guaiquil, V. H., et al. A murine model for retinopathy of prematurity identifies endothelial cell proliferation as a potential mechanism for plus disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5294-5302 (2013).
- Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science: Official Publication of the American Academy of Optometry. 93 (10), 1268-1279 (2016).
- Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
- Kim, A. Y., et al. Quantifying microvascular density and morphology in diabetic retinopathy using spectral-domain optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 362 (2016).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
- Kern, T. S., Antonetti, D. A., Smith, L. E. H. Pathophysiology of diabetic retinopathy: Contribution and limitations of laboratory research. Ophthalmic Research. 62 (4), 196-202 (2019).
- Lorenc, V. E., et al. IGF-1R regulates the extracellular level of active MMP-2, pathological neovascularization, and functionality in retinas of OIR mouse model. Molecular Neurobiology. 55 (2), 1123-1135 (2018).
- Ma, N., Streilein, J. W. Contribution of microglia as passenger leukocytes to the fate of intraocular neuronal retinal grafts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (12), 2384-2393 (1998).
- Mazzaferri, J., Larrivée, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 3916 (2018).
- Milde, F., Lauw, S., Koumoutsakos, P., Iruela-Arispe, M. L. The mouse retina in 3D: quantification of vascular growth and remodeling. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro (Camb). 5 (12), 1426-1438 (2013).
- Yang, T., et al. Pericytes of indirect contact coculture decrease integrity of inner blood-retina barrier model in vitro by upgrading MMP-2/9 activity. Disease Markers. 2021, 7124835 (2021).
- Huang, Q., Wang, S., Sorenson, C. M., Sheibani, N. PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration. Experimental Eye Research. 87 (3), 226-241 (2008).
- Jiang, H., Zhang, H., Jiang, X., Wu, S. Overexpression of D-amino acid oxidase prevents retinal neurovascular pathologies in diabetic rats. Diabetologia. 64 (3), 693-706 (2021).
