Protocolo Econômico e Eficiente para Isolar e Culturing Células Dendríticas Derivadas da Medula Óssea de camundongos
Summary
Aqui, apresentamos um método econômico e eficiente para isolar e gerar células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongos após 7 dias de cultura com 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.
Abstract
A demanda por células dendríticas (DCs) está aumentando gradualmente à medida que a pesquisa em imunologia avança. No entanto, os DCs são raros em todos os tecidos. O método tradicional de isolação de DCs envolve principalmente induzir a diferenciação de medula óssea (MT) em DCs, injetando grandes doses (>10 ng/mL) de fator estimulante da colônia granulocito-macrófago/interleucina-4 (GM-CSF/IL-4), tornando o procedimento complexo e caro. Neste protocolo, utilizando todas as células BM cultivadas em 10 ng/mL GM-CSF/IL-4, após 3-4 trocas de meia cultura, até 2,7 x 107 células CD11c+ (DCs) por rato (dois fêmures) foram colhidas com uma pureza de 80%-95%. Após 10 dias na cultura, a expressão de CD11c, CD80 e MHC II aumentou, enquanto o número de células diminuiu. O número de células atingiu o pico após 7 dias de cultura. Além disso, este método levou apenas 10 minutos para colher todas as células de medula óssea, e um alto número de DCs foram obtidos após 1 semana de cultura.
Introduction
As células dendríticas (DCs) são as células mais poderosas que apresentam antígeno (APCs) para ativar células T ingênuas e induzir respostas específicas de linfócitos T citotóxicos específicos (CTL) contra doenças infecciosas, doenças alérgicas e células tumorais 1,2,3. Os DCs são o principal elo entre imunidade inata e imunidade adaptativa e desempenham um papel essencial na defesa imunológica e na manutenção da tolerância imunológica. Nos últimos 40 anos, muitos pesquisadores têm procurado definir os subconjuntos dos DCs e suas funções em inflamação e imunidade. De acordo com esses estudos, os DCs desenvolvem-se ao longo das linhagens mieloide e linfoides a partir de células de medula óssea. As vacinas tumorais ganharam marcos significativos nos últimos anos e têm um futuro promissor. Mecanicamente, as vacinas tumorais modulam a resposta imune e previnem o crescimento do tumor ativando linfócitos T citotóxicos usando antígenos tumorais. A vacina baseada em DCs desempenha um papel importante na imunoterapia tumoral e foi identificada como uma das terapias anti-tumores mais promissoras 1,4. Além disso, os DCs têm sido amplamente utilizados nos testes de novas drogas de alvo molecular e inibidores de ponto de verificação imunológico5.
Os pesquisadores precisam urgentemente de um alto número de DCs de alta pureza para estudar melhor o papel dos DCs. No entanto, os DCs são raros em vários tecidos e sangue, representando apenas 1% das células sanguíneas em humanos e animais. A cultura in vitro de células dendríticas de medula óssea (BMDC) é um método importante para a obtenção de grandes quantidades de células DC. Enquanto isso, o protocolo Lutz para geração de DCs a partir da medula óssea tem sido amplamente utilizado pelos pesquisadores6. Embora o protocolo seja eficaz na obtenção de células DC, é complexo e caro, envolvendo a adição de altas concentrações de citocinas e a lise dos glóbulos vermelhos.
Neste estudo, relatamos um método para isolar quase todas as células de medula óssea da medula óssea do camundongo (MMO) e induzir a diferenciação em BMDC após 7-9 dias de incubação in vitro, com menor concentração de GM-CSF e IL-4. Este procedimento leva apenas 10 minutos para colher quase todas as células de medula óssea e suspendê-las em um meio completo. Em suma, fornecemos um método de cultivo eficiente e econômico para o BMDC nesta pesquisa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Humanos e camundongos têm diferentes subconjuntos dc, incluindo DCs clássicos (cDCs, incluindo cDC1s e cDC2s) DCs plasmacitóides (pDCs) e DCs derivados de monócitos (MoDCs)9,10,11. É geralmente aceito que os cDC1s regulam as respostas citotóxicas de Linfocito T (CTL) a patógenos intracelulares e câncer, e os cDC2s regulam respostas imunes a patógenos extracelulares, parasitas e alérgenos12. Um n…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Programa do Plano de Ciência e Tecnologia de Tianjin (20JCQNJC00550), Tianjin Health Science and Technology Project (TJWJ202021QN033 e TJWJ202021QN034).
Materials
| β-Mercaptoethanol | Solarbio | M8211 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| APC-MHC II | Biolegend | 116417 | |
| FBS | Gibco | 10100 | |
| PE-CD80 | Biolegend | 104707 | |
| Penicillin-Streptomycin | Solarbio | P1400 | |
| Percp/cy5.5-CD11c | Biolegend | 117327 | |
| PRMI-1640 | Thermo | 11875093 | |
| Recombinant Mouse GM-CSF | Solarbio | P00184 | |
| Recombinant Mouse IL-4 | Solarbio | P00196 | |
| TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 156603 |
Referencias
- Huang, M. N., et al. Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).
- Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M. Direct loading of CTL epitopes onto MHC class I complexes on dendritic cell surface in vivo. Biomaterials. 182, 92-103 (2018).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Jiang, P. L., et al. Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity. Acta Biomaterialia. 11, 356-367 (2015).
- Shi, Y., et al. Next-generation immunotherapies to improve anticancer immunity. Frontiers in Pharmacology. 11, 566401 (2020).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Son, Y. I., et al. A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells. Journal of Immunological Methods. 262 (1-2), 145-157 (2002).
- Guo, L., et al. Fusion protein vaccine based on Ag85B and STEAP1 induces a protective immune response against prostate cancer. Vaccines. 9 (7), 786 (2021).
- Olweus, J., et al. Dendritic cell ontogeny: A human dendritic cell lineage of myeloid origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (23), 12551-12556 (1997).
- Martin, P., et al. Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors. Blood. 96 (-), 2511-2519 (2000).
- Anderson, D. A., Dutertre, C. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews: Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).
- Vu Manh, T. P., Bertho, N., Hosmalin, A., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M. Investigating evolutionary conservation of dendritic cell subset identity and functions. Frontiers in Immunology. 6, 260 (2015).
- Scheicher, C., Mehlig, M., Zecher, R., Reske, K. Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Journal of Immunological Methods. 154 (2), 253-264 (1992).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Mayordomo, J. I., et al. marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nature Medicine. 1 (12), 1297-1302 (1995).
- Condon, C., Watkins, S. C., Celluzzi, C. M., Thompson, K., Falo, L. D. DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells. Nature Medicine. 2 (10), 1122-1128 (1996).
- Brunner, G. A., et al. Post-prandial administration of the insulin analogue insulin aspart in patients with type 1 diabetes mellitus. Diabetic Medicine. 17 (5), 371-375 (2000).
- Koido, S., et al. Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA. Journal of Immunology. 165 (10), 5713-5719 (2000).
- Jonasson, P. S., et al. Strength of the porcine proximal femoral epiphyseal plate: The effect of different loading directions and the role of the perichondrial fibrocartilaginous complex and epiphyseal tubercle – An experimental biomechanical study. Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 4 (2014).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. Journal of Immunology. 162 (1), 168-175 (1999).
- Hinkel, A., et al. Immunomodulatory dendritic cells generated from nonfractionated bulk peripheral blood mononuclear cell cultures induce growth of cytotoxic T cells against renal cell carcinoma. Journal of Immunotherapy. 23 (1), 83-93 (2000).
