Ensayo de uracilo-ADN glicosilasa mediante desorción láser asistida por matriz/análisis de espectrometría de masas de tiempo de vuelo

Aunque el uracilo es una base normal en el ARN, es una lesión común y altamente mutagénica en el ADN genómico. El uracilo puede surgir de la desaminación hidrolítica espontánea/enzimática de una desoxicitidina. En cada célula viva, esta desaminación ocurre 100-500 veces al día en condiciones ^{fisiológicas1,2}. Si estas alteraciones no se reparan, puede haber un cambio en la composición de la secuencia de ADN, causando mutación. Como el uracilo en el ADN prefiere emparejarse con dATP durante la replicación, si la citosina se desamina a uracilo, en dos eventos de replicación, habrá una nueva mutación de transición de G:C a A:T en la mitad de la progenie ^DNA3.

Entre las estrategias celulares para mantener la estabilidad genética, la reparación por escisión de bases (BER) es un mecanismo esencial que repara las bases dañadas, como el uracilo, en el ^ADN4. BER es un proceso altamente conservado evolutivamente. Existen dos vías generales de BER: la vía de parche corto que conduce a un tracto de reparación de un solo nucleótido y la vía de parche largo que produce un tracto de reparación de al menos dos nucleótidos5. BER es un mecanismo coordinado que se produce en varios pasos. El primer paso en BER es la hidrólisis enzimática de la base de nucleótidos dañada por una GLICosilasa de ADN específica del daño para generar un sitio intermedio apurínico/apirimidínico (AP)⁶. Esto es seguido por la escisión de la columna vertebral de azúcar-fosfato en el sitio AP por una endonucleasa, la limpieza de los extremos del ADN por una liasa, el llenado de huecos por una ADN polimerasa y el sellado del corte final por una ^ligasa5.

La uracilo-ADN glicosilasa (UDG) hidroliza el uracilo del ADN que contiene uracilo para BER en Escherichia coli. Los ensayos convencionales de UDG que utilizan ADN radiomarcado que involucran diferentes técnicas de separación6,7,8,9,10,11,12,13 suelen requerir mucho tiempo, mano de obra, con costosos reactivos de etiquetado, procedimientos complicados y que requieren capacitación y práctica intensivas para reducir los riesgos de exposición a materiales radiactivos. Se han desarrollado ensayos fluorométricos de oligonucleótidos como sustituto del etiquetado de radioisótopos14, además de balizas moleculares y tecnología de transferencia de energía de resonancia de Förster15,16,17,18,19,20. Sin embargo, se requiere un etiquetado específico para todos los métodos antes mencionados. Recientemente se han desarrollado ensayos de biosensores libres de ^{etiquetas21,22,23} y métodos colorimétricos basados en la formación de un G-quadruplex24,25,26. Sin embargo, múltiples pares A:U o secuencias especialmente diseñadas en las sondas complican la definición de la unidad enzimática.

MALDI-TOF MS es una tecnología que podría ser de gran utilidad en el análisis de ADN. Las aplicaciones desarrolladas incluyen el genotipado de polimorfismo de un solo nucleótido27,28, el análisis de nucleótidos ^{modificados29} y la identificación intermedia de reparación de ^{ADN30,31,32,33,34}. MALDI-TOF MS debe adoptarse fácilmente para el análisis de glicosilasa de ADN para detectar productos de ADN que contienen sitios AP. Sin embargo, los sitios AP en el ADN son propensos a la rotura de hebras bajo muchas condiciones ^{experimentales33}. Aquí se presenta un ensayo UDG utilizando MALDI-TOF MS para medir directamente la producción del sitio AP sin un ruido significativo de rotura de hebras. Este método sin etiqueta es fácil de trabajar y tiene un alto potencial para la aplicación farmacéutica de la detección de inhibidores de la GLUCosilasa de ADN.