マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析分析によるウラシル-DNAグリコシラーゼアッセイ

ウラシルはRNAの正常な塩基であるが、ゲノムDNAにおいて一般的で変異原性の高い病変である。ウラシルは、デオキシシチジンの自発的/酵素的加水分解脱アミノ化から生じ得る。各生細胞において、この脱アミノ化は生理学的条件下で1日100〜500回起こる^1,2。これらの変化が修復されない場合、DNA配列組成に変化があり、突然変異を引き起こす可能性がある。DNA中のウラシルは複製中にdATPと対合することを好むので、シトシンがウラシルに脱アミノ化する場合、2つの複製事象において、子孫DNAの半分に新しいG:CからA:Tへの移行変異が存在する³。

遺伝的安定性を維持するための細胞戦略の中で、塩基切除修復(BER)は、^DNA4のウラシルなどの損傷した塩基を修復する重要なメカニズムである。BERは高度に進化的に保存されたプロセスです。2つの一般的なBER経路がある:単一ヌクレオチドの修復路に至る短いパッチ経路と、少なくとも2ヌクレオチドの修復経路を生成するロングパッチ経路⁵。BERは、いくつかのステップで発生する調整されたメカニズムです。BERの最初のステップは、損傷特異的DNAグリコシラーゼによる損傷ヌクレオチド塩基の酵素加水分解であり、アプリニン/アピリミジン(AP)中間部位^{を生成する6}。これに続いて、エンドヌクレアーゼによるAP部位の糖リン酸骨格の切断、リアーゼによるDNA末端のクリーンアップ、DNAポリメラーゼによるギャップ充填、およびリガーゼによる最終ニックの封止^{が続きます5}。

ウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)は、大腸菌中のBERのウラシル含有DNAからウラシルを加水分解する。異なる分離技術を含む放射性標識DNAを用いた従来のUDGアッセイ⁶、⁷、⁸、⁹、¹⁰、¹¹、¹²、¹³は、通常、時間がかかり^、労働集約的であり、高価な標識試薬、複雑な手順^、および放射性物質への曝露のリスクを低減するために集中的な訓練と実践を必要とする。蛍光測定オリゴヌクレオチドアッセイは、分子ビーコンおよびフェルスター共鳴エネルギー移動技術に加えて、放射性同位元素標識¹⁴の代替として開発されている15,16,17,18,19,20。しかしながら、前述の方法の全てに特定の標識が必要である。近年、ラベルフリーバイオセンサアッセイ21、^22、23およびG−quadruplex24^、25、26の形成に基づく比色法が開発されている。しかし、プローブ内の複数のA:Uペアまたは特別に設計された配列は、酵素単位の定義を複雑にします。

MALDI-TOF MS は、DNA 解析に非常に役立つ可能性のある技術です。開発されたアプリケーションには、一塩基多型ジェノタイピング^27,28、改変ヌクレオチド解析²⁹、DNA修復中間体同定30,31,32,33,34が含まれる。MALDI-TOF MS は、AP 部位含有 DNA 産物を検出するための DNA グリコシラーゼ分析に容易に採用する必要があります。しかし、DNA中のAP部位は、多くの実験条件下で鎖が切断されやすい³³。ここでは、MALDI-TOF MS を使用して UDG アッセイを行い、大きなストランドブレークノイズなしで AP サイト生産を直接測定します。このラベルフリー法は、取り扱いが容易であり、DNAグリコシラーゼ阻害剤スクリーニングの医薬応用に高い可能性を秘めています。