Ручное построение тканевого микрочипа с использованием ленточного метода и портативного микрочипа

Одним из наиболее важных компонентов процесса строительства TMA является патологический обзор донорских блоков FFPE, из которых будут получены ядра TMA⁴. Во время обзора сертифицированный патологоанатом исследует репрезентативный участок окрашенной ткани H&E из каждого донорского блока. Крайне важно, чтобы H & E генерировался с использованием свежеразрезанного участка ткани, чтобы он был лучшим представлением соответствующего донорского блока. Использование более старых H&Es не рекомендуется, учитывая, что ткани FFPE представляют собой 3-мерные структуры, профиль ткани которых может значительно изменяться с глубиной блока и обширным сечением; это могло произойти с тех пор, как был сгенерирован H&E, что потенциально делает его представление блока FFPE неточным. Процесс обзора имеет важное значение для отбора подходящих случаев и выявления участков тканей, из которых должны быть получены керны, а также для выявления областей, которых следует избегать при сборе кернов. При отсутствии патологического обзора вероятность включения неподходящих тканей значительно возрастает. Включение таких тканей может сделать построенную ТМА неэффективной и непригодной для ее целевого назначения. Важно отметить, что неосознанное использование таких неэффективных TMA имеет огромный потенциал для получения ложных и вводящих в заблуждение данных. Это в сочетании со знанием того, что профиль тканей FFPE и, следовательно, их производных ядер может значительно изменяться с увеличением глубины, подчеркивает важность продолжения обзора патологии в течение всего срока службы построенного блока TMA. В идеале H&Es должен генерироваться с использованием каждой^15-й или^20-й секции, чтобы обеспечить захват и регистрацию любых изменений в профилях тканей ядер. Как минимум, H&Es должны генерироваться и пересматриваться в начале и в конце проекта для мониторинга этих потенциальных изменений. В свете этих моментов и важности TMA как исследовательского инструмента крайне важно, чтобы патологический обзор прочно вошел в процесс строительства TMA и на протяжении всего срока службы блока TMA.

Блоки FFPE часто широко секционируются во время рутинной диагностической обработки, прежде чем быть выпущенными для исследовательских целей. В результате глубина донорского блока и, следовательно, длина ядра донорского блока часто меньше, чем идеальный метод реципиента 4 мм. Здесь мы продемонстрировали, как конструировать TMA с использованием протокола построения ленточного метода, основным преимуществом которого является его совместимость с сердечниками из неидеальных тканевых блоков FFPE. Хотя ленточный метод имеет большую исследовательскую ценность и предлагает недорогой, удобный и доступный метод построения блоков TMA, он не лишен своих проблем и ограничений. По сравнению с автоматизированными и ручными методами реципиента, которые могут вместить 100-1000 ядер в одном блоке TMA, для TMA, для TMA, построенных с использованием ленточного метода⁹, рекомендуется максимум 40 ядер. Еще одно ограничение касается простоты строительства. В методе реципиента перфорированные сердечники просто вставляются в сборную форму, которая обеспечивает стабильность сердечника путем заключения каждого сердечника в его собственную индивидуальную скважину, тем самым предотвращая миграцию ядра, а также способствуя очень регулярному размещению и разделению^{ядра 22}. Кроме того, метод получателя предлагает дополнительное удобство быть полностью ручным, полуручным и полностью автоматизированным. Напротив, ручной метод ленты требует осторожного, бережного размещения каждого стержня вручную с помощью игольчатого отмычка. Хотя отсутствие сборной формы в ленточном методе исключает очень регулярное размещение и разделение, испытываемое с помощью метода реципиента, этот недостаток преодолевается путем включения клетчатой сетки. Важно, чтобы клетчатая сетка прикреплялась к центру металлического лотка, чтобы избежать размещения кромки блока, что увеличивает риск потери сердечника при недостаточном количестве парафина, удерживающего сердечник на месте. Следует также отметить, что разделение небольших сердечников, возможное с помощью метода реципиента, не может быть достигнуто с помощью ленточного метода из-за ручного размещения сердечника и необходимости того, чтобы игольчатый отмычек помещался между соседними сердечниками. Сердечники размещаются в отдельно стоящем вертикальном режиме с наименьшей площадью поверхности или площадью сердечника, контактирующего с сеткой, покрытой DSST. Эта установка обеспечивает значительно меньшую стабильность ядра, чем метод реципиента, и повышает риск опрокидывания и/или миграции ядра при заливке расплавленного парафина. Действительно, одним из наиболее важных шагов в протоколе является заливка расплавленного парафина. Важно, чтобы это было сделано быстро после извлечения из печи, чтобы убедиться, что парафин полностью жидкий и что заливка выполняется осторожно с минимальной турбулентностью. Интересно, что Chen et al. разработали очень новое вспомогательное устройство, похожее на трафарет с 7 x 11 равномерно распределенными отверстиями диаметром 2 мм, которое помещается поверх пустого парафинового блока для направления игл при создании блока реципиента и при вставке донорского блока^{сердечников 23}. Несмотря на то, что такое устройство предназначено для облегчения строительства блока получателя, оно может быть легко адаптировано к ленточному методу для управления размещением, регулирования разделения и повышения стабильности сердечника во время процесса строительства.

Одним из наиболее значимых эффекторов стабильности ядра является количество ядер, входящих в ленточный метод TMA. Это связано с тем, что по мере увеличения числа ядер диаметр ядра должен уменьшаться, чтобы вместить растущее число ядер, что, в свою очередь, уменьшает площадь ядра, придерживающуюся DSST. Минимальный диаметр сердечника 1 мм рекомендуется для конструкции TMA ленточным методом, так как мы обнаружили, что сердечники с меньшими диаметрами особенно нестабильны и склонны к опрокидыванию даже при очень щадящем заливке парафином. Недавнее исследование, изучающее два различных внутренних метода, в которых использовались иглы 16 G (диаметр сердечника 1,1 мм) и перфоратор диаметром 4 мм, испытало значительные потери тканей с 1,1 мм (26,5%), но не с сердечниками 4 мм²⁴. Это, по-видимому, указывает на то, что с небольшими ядрами может быть проблематично работать, а не только во время строительства. Кроме того, меньшие диаметры могут не представлять исходный донорский блок, а также более крупные ядра, что затрудняет патологическую интерпретацию и увеличивает вероятность неточного представления донорской ткани.

Включение и размещение блоков ориентации имеет огромное значение в строительстве TMA. Однако это имеет особое значение для конструируемых ТМА ленточным методом. Это связано с тем, что ленточный метод инвертирует процесс строительства, тем самым увеличивая риск пространственной дезориентации. Мы советуем включать до трех ядер ориентации в каждый блок и размещать их вдали от кернов образца, чтобы наилучшим образом ориентировать блок. Ориентационные ядра могут быть ядрами, взятыми из тканевых блоков, содержащих отчетливо отличающиеся ткани из темы построенного TMA или бестканевого цвета инструменты ориентации²¹, где последний особенно полезен для непатологоанатомов. В сочетании с нерегулярным матричным шаблонным размещением ядер ориентации ядра минимизируют риск дезориентации.

Выраженная разница в длине керна между TMA, построенными с использованием ленточного и реципиентного методов, обусловлена включением глубины донорского блока в процесс принятия решений при выборе метода построения. Протокол, описанный здесь, использует пороговое значение, при котором TMA строятся с использованием ленточного и реципиентного методов, когда донорские блоки имеют глубину <4 мм и 4 мм соответственно. Важно отметить, что включение глубины донорского блока в выбор метода строительства не является универсальным. Хотя TMA могут быть построены с использованием любого метода независимо от глубины донорского блока, более высокие сердечники могут мешать и или быть опрокинутыми или наклоненными размещением пластиковой кассеты во время строительства TMA с использованием ленточного метода. Выбор включения или исключения критериев в процессе принятия решений зависит от удобств, доступных для лаборатории, стоимости и желаемого конечного продукта. По параметрам этого протокола количество смонтированных на слайдах участков TMA, которые могут быть получены из ленточного метода, построенного TMA, значительно меньше, чем количество полученных из метода реципиента, построенного TMA. Хотя можно повторно блокировать ткани FFPE, чтобы увеличить глубину донорского блока и сделать их совместимыми с методом реципиента, вероятность достижения той же ориентации ткани в пределах повторного блока низка. В свою очередь, это может потребовать обширной облицовки блока для получения полного участка лица, что, вероятно, будет включать значительную потерю тканей. После облицовки блока ленточным методом TMA получается около 50 секций TMA, установленных на слайдах, со всеми присутствующими сердечниками. Однако точное число будет варьироваться от блока к блоку и зависит от длины сердечников, используемых для построения TMA, и толщины разрезаемых секций (5 мкм против 4 мкм). Кроме того, следует также отметить, что из-за их различной длины ядра ядра будут исчерпываться в разное время по мере постепенного разделения TMA; атрибут, который вновь подчеркивает необходимость продолжения патологического обзора.

Хотя метод реципиента предлагает значительные преимущества и преимущества по сравнению с ленточным методом, включая менее утомительные и более быстрые процессы строительства, ленточный метод не предназначен для опытных лабораторий с высокой пропускной способностью. Он предназначен для средних лабораторий, особенно в условиях ограниченных ресурсов, с доступом к донорским блокам различной глубины, но не к строительным услугам TMA. Тем не менее, в будущих приложениях можно было бы автоматизировать этот метод, чтобы расширить пул приемлемых образцов в лабораториях с высокой пропускной способностью и устранить необходимость повторной блокировки донорских блоков. В заключение, описанный протокол построения ленточного метода TMA может быть легко установлен в неспециализированных лабораториях без необходимости дорогостоящего оборудования. Тем не менее, рекомендуется, чтобы новые пользователи сначала использовали тканевые блоки FFPE, не имеющие ценности, инструменты ориентации²¹ без ткани без ткани или даже цветные парафиновые блоки без ткани, чтобы ознакомиться с техникой ленточного метода, прежде чем переходить к строительству TMA с использованием драгоценных тканей. Хотя их строительство не лишено потенциальных ловушек, о которых должны знать как те, кто строит и использует блоки TMA, этот, казалось бы, неполированный «самодельный» метод строительства TMA может дать высококачественные, биологически значимые TMA для исследований. Действительно, участки TMA, полученные из ТМА, построенные ленточным методом, являются одними из наиболее востребованных образцов тканей в биорепозитории ACSR.