Handmatige constructie van een weefselmicroarray met behulp van de tapemethode en een handheld microarrayer

Een van de meest kritische componenten van het TMA-bouwproces is pathologiebeoordeling van FFPE-donorblokken waaruit de TMA-kernen zullen worden verkregen⁴. Tijdens de beoordeling onderzoekt een door de raad gecertificeerde patholoog een representatieve H & E-gekleurde weefselsectie van elk donorblok. Het is absoluut noodzakelijk dat de H & E wordt gegenereerd met behulp van een vers gesneden weefselsectie, zodat het de beste weergave is van het bijbehorende donorblok. Het gebruik van oudere H&Es wordt niet aanbevolen, aangezien FFPE-weefsels 3-dimensionale structuren zijn waarvan het weefselprofiel aanzienlijk kan veranderen met blokdiepte en uitgebreide sectie; dit kan zijn gebeurd sinds de H & E werd gegenereerd, waardoor de weergave van het FFPE-blok mogelijk onnauwkeurig is. Het beoordelingsproces is van essentieel belang voor de selectie van geschikte gevallen en de identificatie van weefselgebieden waaruit kernen moeten worden verkregen, evenals voor de identificatie van gebieden die moeten worden vermeden bij het verzamelen van kernen. Bij afwezigheid van pathologische beoordeling neemt de kans op het opnemen van ongeschikte weefsels aanzienlijk toe. Het opnemen van dergelijke weefsels kan de geconstrueerde TMA ineffectief en ongeschikt maken voor het beoogde doel. Belangrijk is dat het onbewust gebruiken van dergelijke ineffectieve TMA’s een enorm potentieel heeft om te resulteren in valse en misleidende gegevens. Dit in combinatie met de wetenschap dat het profiel van FFPE-weefsels, en dus hun afgeleide kernen, aanzienlijk kan veranderen met toenemende diepte benadrukt het belang van voortdurende pathologiebeoordeling gedurende de levensduur van een geconstrueerd TMA-blok. Idealiter moeten H &E’s worden gegenereerd met behulp van elke^15e of^20e sectie om ervoor te zorgen dat eventuele veranderingen in de weefselprofielen van de kernen worden vastgelegd en geregistreerd. Op zijn minst moeten H&E’s worden gegenereerd en beoordeeld aan het begin en einde van een project om deze potentiële veranderingen te monitoren. In het licht van deze punten en het belang van de TMA als onderzoeksinstrument, is het noodzakelijk dat de pathologische beoordeling stevig is ingebed in het TMA-bouwproces en gedurende de hele levensduur van het TMA-blok.

FFPE-blokken worden vaak uitgebreid gesneden tijdens routinematige diagnostische verwerking voordat ze worden vrijgegeven voor onderzoeksdoeleinden. Hierdoor zijn de diepte van het donorblok en dus de lengte van de donorblokkern vaak minder dan de ontvangermethode van 4 mm. Hier hebben we gedemonstreerd hoe TMA’s kunnen worden geconstrueerd met behulp van het tapemethodeconstructieprotocol, waarvan het belangrijkste voordeel de compatibiliteit is met kernen van niet-ideale FFPE-weefselblokken. Hoewel de tapemethode van grote onderzoekswaarde is en een goedkope, handige en toegankelijke methode biedt voor het bouwen van TMA-blokken, is deze niet zonder uitdagingen en beperkingen. In vergelijking met zowel geautomatiseerde als handmatige ontvangstmethoden, die plaats bieden aan 100-1.000 kernen in één TMA-blok, wordt een maximum van 40 kernen aanbevolen voor TMA’s die zijn geconstrueerd met behulp van de tapemethode⁹. Een andere beperking is met betrekking tot het gemak van de bouw. In de ontvangermethode worden gestanste kernen slechts in een prefab-mal geplaatst, die kernstabiliteit biedt door elke kern in zijn eigen individuele put te omhullen, waardoor kernmigratie wordt voorkomen en zeer regelmatige kernplaatsing en -scheiding^{wordt bevorderd 22}. Bovendien biedt de ontvangermethode het optionele gemak om volledig handmatig, semi-handmatig en volledig geautomatiseerd te zijn. De handmatige tapemethode vereist daarentegen een zorgvuldige, zachte plaatsing van elke kern met de hand met behulp van een naaldprikker. Hoewel de afwezigheid van een prefab-mal in de tapemethode de zeer regelmatige plaatsing en scheiding die wordt ervaren met de ontvangermethode uitsluit, wordt dit tekort overwonnen door de opname van een geblokt raster. Het is belangrijk dat het geblokte rooster in het midden van de metalen lade wordt bevestigd om plaatsing van de blokrand te voorkomen, wat het risico op kernverlies verhoogt als er onvoldoende paraffine is dat de kern op zijn plaats houdt. Er moet ook worden opgemerkt dat de kleine kernscheidingen die mogelijk zijn met de ontvangermethode niet kunnen worden bereikt met de tapemethode vanwege de handmatige plaatsing van de kern en de noodzaak dat de naaldprikker tussen aangrenzende kernen past. Kernen worden vrijstaand geplaatst met het kleinste oppervlak of de kleinste voetafdruk van de kern die in contact komt met het met DSST bedekte raster. Deze opstelling biedt aanzienlijk minder kernstabiliteit dan de ontvangermethode en geeft een verhoogd risico op kernomvervorming en of migratie bij het gieten van de gesmolten paraffine. Inderdaad, een van de meest kritieke stappen in het protocol is het gieten van de gesmolten paraffine. Het is essentieel dat dit snel gebeurt na verwijdering uit de oven om ervoor te zorgen dat de paraffine volledig vloeibaar is en dat het gieten voorzichtig wordt uitgevoerd met minimale turbulentie. Interessant is dat Chen et al. een zeer nieuw hulpapparaat ontwikkelden, vergelijkbaar met een stencil met gaten met een diameter van 7 x 11 x 11 gelijkmatig verdeeld en 2 mm, dat bovenop een leeg paraffineblok wordt geplaatst om naalden te geleiden bij het maken van het ontvangerblok en bij het inbrengen van de donorblokkernen²³. Hoewel ontworpen om de bouw van het ontvangerblok te ondersteunen, kan een dergelijk apparaat eenvoudig worden aangepast aan de tapemethode om de plaatsing te begeleiden, de scheiding te regelen en de kernstabiliteit tijdens het bouwproces te vergroten.

Een van de belangrijkste effectoren van kernstabiliteit is het aantal kernen dat is opgenomen in een tapemethode TMA. Dit komt omdat naarmate het aantal kernen toeneemt, de diameter van de kern moet afnemen om het toenemende aantal kernen op te vangen, wat op zijn beurt de kernvoetafdruk vermindert die zich aan de DSST houdt. Een minimale kerndiameter van 1 mm wordt aanbevolen voor tapemethode TMA-constructie, omdat we hebben ontdekt dat kernen met kleinere diameters bijzonder onstabiel zijn en vatbaar voor omvallen, zelfs met zeer zachte paraffinegieten. Een recente studie die twee verschillende interne methoden onderzocht waarbij 16 G-naalden (kerndiameter van 1,1 mm) en een pons met een diameter van 4 mm werden gebruikt, ondervond aanzienlijke weefselverliezen met de 1,1 mm (26,5%) maar niet met de 4 mm-kernen²⁴. Dit lijkt erop te wijzen dat kleine kernen problematisch kunnen zijn om mee te werken en niet alleen tijdens de bouw. Bovendien vertegenwoordigen kleinere diameters mogelijk niet het oorspronkelijke donorblok en grotere kernen, waardoor pathologische interpretatie moeilijk wordt en de kans op onnauwkeurige donorweefselrepresentatie toeneemt.

Het opnemen en plaatsen van oriëntatieblokken is van groot belang in de TMA-constructie. Dit is echter van bijzonder belang voor tapemethode geconstrueerde TMA’s. Dit komt voort uit het feit dat de tapemethode het bouwproces omkeert, waardoor het risico op ruimtelijke desoriëntatie toeneemt. We adviseren om in elk blok maximaal drie oriëntatiekernen op te nemen en deze uit de buurt van de monsterkernen te plaatsen om het blok het beste te oriënteren. Oriëntatiekernen kunnen kernen zijn die zijn genomen van weefselblokken die duidelijk verschillende weefsels bevatten uit het thema van de geconstrueerde TMA of weefselvrij gekleurde oriëntatiehulpmiddelen²¹, waarbij dit laatste vooral nuttig is voor niet-pathologen. In combinatie met niet-regelmatige matrixpatroonkernplaatsing minimaliseren oriëntatiekernen het risico op desoriëntatie.

Het uitgesproken verschil in kernlengte tussen TMA’s die zijn geconstrueerd met behulp van de tape- en ontvangermethoden komt voort uit het opnemen van donorblokdiepte in het besluitvormingsproces bij het selecteren van de bouwmethode. Het hier beschreven protocol hanteert een drempel waarbij TMA’s worden geconstrueerd met behulp van de tape- en ontvangermethoden wanneer de donorblokken een diepte van respectievelijk <4 mm en 4 mm hebben. Het is belangrijk op te merken dat het opnemen van donorblokdiepte in de keuze van de bouwmethode niet universeel is. Hoewel het mogelijk is dat TMA's met behulp van beide methoden worden geconstrueerd, ongeacht de diepte van het donorblok, kunnen hogere kernen de plaatsing van de plastic cassette tijdens de TMA-constructie met behulp van de tapemethode verstoren en of omvallen of kantelen. De keuze om criteria op te nemen of weg te laten in het besluitvormingsproces hangt af van de voorzieningen die beschikbaar zijn voor het laboratorium, de kosten en het gewenste eindproduct. Onder de parameters van dit protocol is het aantal op dia's gemonteerde TMA-secties dat kan worden verkregen uit een tapemethode geconstrueerde TMA aanzienlijk minder dan dat verkregen uit een ontvangermethode geconstrueerd TMA. Hoewel het mogelijk is om FFPE-weefsels opnieuw te blokkeren om de diepte van het donorblok te vergroten en ze compatibel te maken met de ontvangermethode, is de kans op het bereiken van dezelfde weefseloriëntatie binnen het herblok laag. Dit kan op zijn beurt een uitgebreide blokbekleding vereisen om een volledige sectie te verkrijgen, wat waarschijnlijk aanzienlijk weefselverlies zou omvatten. Na blokzijde levert een tapemethode geconstrueerde TMA ongeveer 50 op dia gemonteerde TMA-secties op met alle kernen aanwezig. Het exacte aantal varieert echter van blok tot blok en hangt af van de lengte van de kernen die worden gebruikt om de TMA te construeren en de dikte van de secties die worden gesneden (5 μm versus 4 μm). Bovendien moet ook worden opgemerkt dat vanwege hun verschillende kernlengtes, de kernen op verschillende tijdstippen zullen uitputten naarmate de TMA geleidelijk wordt gesneden; een attribuut dat de noodzaak van voortdurende pathologische herziening opnieuw benadrukt.

Hoewel de ontvangermethode aanzienlijke voordelen en voordelen biedt ten opzichte van de tapemethode, waaronder een minder vervelend en sneller bouwproces, is de tapemethode niet gericht op ervaren laboratoria met een hoge doorvoer. Het is gericht op het gemiddelde laboratorium, met name die in omgevingen met beperkte middelen, met toegang tot donorblokken van variabele diepten, maar niet tot TMA-bouwdiensten. Toekomstige toepassingen zouden echter automatisering van deze methode kunnen zien om de pool van in aanmerking komende monsters in laboratoria met een hoge doorvoer te verbeteren en de noodzaak van het opnieuw blokkeren van donorblokken te elimineren. Kortom, het beschreven TMA-tapemethodeconstructieprotocol kan eenvoudig worden vastgesteld in niet-gespecialiseerde laboratoria zonder dat dure apparatuur nodig is. Het wordt echter geadviseerd dat nieuwe gebruikers FFPE-weefselblokken zonder waarde, weefselvrije gekleurde oriëntatiehulpmiddelen²¹ of zelfs gekleurde paraffineblokken zonder weefsel in eerste instantie moeten gebruiken om vertrouwd te raken met de tapemethodetechniek voordat ze doorgaan naar TMA-constructie met behulp van kostbare weefsels. Hoewel hun constructie niet zonder potentiële valkuilen is, waar zowel degenen die TMA-blokken bouwen als gebruiken zich bewust van moeten zijn, kan deze schijnbaar ongepolijste “zelfgemaakte” TMA-bouwmethode hoogwaardige, biologisch relevante TMA’s voor onderzoek opleveren. Inderdaad, TMA-secties die voortkomen uit tapemethode geconstrueerde TMA’s behoren tot een van de meest gevraagde weefselmonsters in de ACSR-biorepository.