JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Inmunología y contagio

توليد كتلة حيوية أكبر من الأغشية الحيوية البكتيرية باستخدام أجهزة الصفائح الدقيقة العميقة للوحة PCR

Published: April 22, 2022
doi:
10.3791/63069
, , , ,
1Department of Medical Microbiology and Infectious Diseases,University of Manitoba, 2National Microbiology Laboratory,Public Health Agency of Canada

Summary

يقدم هذا البروتوكول منهجية لإجراء نمو الأغشية الحيوية وقياسات الكتلة الحيوية باستخدام أجهزة لوحة تفاعل البوليميراز المتسلسل العميق للبئر المجمعة ذاتيا لفحص الأغشية الحيوية الثابتة ذات الغطاء المربوط جيدا بإنتاجية عالية 96 جيدا.

Abstract

يصعب القضاء على الأغشية الحيوية البكتيرية من الأسطح باستخدام التدخلات التقليدية المضادة للميكروبات. وكثيرا ما تستخدم طرق الصفائح الدقيقة عالية الإنتاجية ذات ال 96 بئرا لزراعة الأغشية الحيوية البكتيرية لاختبار القابلية السريعة لمضادات الميكروبات لحساب الحد الأدنى من قيم تركيز استئصال الأغشية الحيوية (MBEC). تتكون أجهزة الأغشية الحيوية القياسية من أغطية مربوطة بالبوليسترين مثبتة على صفائح دقيقة من 96 بئرا وهي مثالية لقياس الكتلة الحيوية للأغشية الحيوية وقيم MBEC ، ولكن هذه الأجهزة محدودة بمساحة سطح الربط المتاحة لتراكم الكتلة الحيوية والتكلفة. هنا ، نوجز بروتوكولا لاستخدام جهاز الغطاء المربوط بلوحة PCR من البولي بروبيلين المجمعة ذاتيا و 96 بئرا لزراعة الأغشية الحيوية Escherichia coli BW25113 و Pseudomonas aeruginosa PAO1. يتم وصف مقارنة بين الأغشية الحيوية على مدار 24 ساعة التي تم تشكيلها على أجهزة الآبار القياسية والعميقة من قبل كل نوع باستخدام تلطيخ الكتلة الحيوية البنفسجية البلورية واختبارات تحديد MBEC. من المتوقع أن تزيد المساحة السطحية الأكبر لأجهزة الآبار العميقة من تكوين الأغشية الحيوية الإجمالية من قبل كلا النوعين 2-4 أضعاف. شكلت P. aeruginosa كتلة حيوية أكبر بكثير / mm2 على أوتاد الآبار العميقة مقارنة بالجهاز القياسي. كان لدى E. coli كتلة حيوية أكبر / mm2 على أجهزة البوليسترين القياسية مقارنة بجهاز البئر العميق. أظهرت مقايسات استئصال الأغشية الحيوية باستخدام المطهرات مثل هيبوكلوريت الصوديوم (التبييض) أو كلوريد البنزالكونيوم (BZK) أن كلا المركبين يمكن أن يقأصلا الأغشية الحيوية E. coli و P. aeruginosa من كلا الجهازين ولكن بقيم MBEC مختلفة. أدى استئصال الأغشية الحيوية BZK إلى قيم متغيرة للإشريكية القولونية MBEC بين الأجهزة ، ومع ذلك ، أظهر التبييض قيم MBEC قابلة للتكرار لكل من الأنواع والأجهزة. توفر هذه الدراسة طريقة بئر عميقة عالية الإنتاجية لزراعة كميات أكبر من الأغشية الحيوية على أجهزة البولي بروبيلين للدراسات النهائية التي تتطلب كميات أعلى من الأغشية الحيوية الثابتة.

Introduction

الزائفة الزنجارية والإشريكية القولونية هي بكتيريا بروتينية سالبة الجرام تتم دراستها عادة لقدرتها على تشكيل مجتمعات خلوية متصلة بالسطح تعرف باسم الأغشية الحيوية1. يمكن لكلا النوعين، عند نموهما كأغشية حيوية، أن يفرزا مصفوفة من المواد البوليمرية خارج الخلية (EPS) تتكون في المقام الأول من السكريات والبروتينات المختلفة، والتي يمكن أن تشمل أيضا الحمض النووي خارج الخلية و / أو الدهون، مما يوفر حماية خلوية إضافية ويعزز البقاء على قيد الحياة في البيئات القاسية والمحدودة المغذيات2،3. فسيولوجيا الأغشية الحيوية وتشكيلها من قبل كلا النوعين ذات أهمية سريرية ، لأنها تمثل مسببات الأمراض الخمسة الأولى المقاومة لمضادات الميكروبات الأكثر عزلا من دم المريض في المستشفى والتهابات المسالك البولية والرئة في كندا4,5. ومن المهم أيضا ملاحظة أن الأغشية الحيوية تشير التقديرات إلى أنها تشكل ما يقرب من 80٪ من جميع أنواع العدوى المزمنة والمتكررة التي تسببها هذه الأنواع البكتيرية6. بسبب مواد EPS المفرزة والنشاط الأيضي الأبطأ7,8 ، يصبح من الصعب القضاء على الأغشية الحيوية الراسخة عندما تتشكل على الأسطح مثل الأجهزة الطبية المزروعة والأنسجة الندبية وفي رئتي مرضى التليف الكيسي9,10 ، مما يزيد من مقاومتها لمضادات الميكروبات.

غالبا ما تجعلها خصائص النمو المتمردة للأغشية الحيوية البكتيرية أكثر مقاومة لتثبيط مضادات الميكروبات و / أو القضاء عليها2,9. وبالتالي ، فإن إنشاء طرق في المختبر لدراسة استئصال مضادات الميكروبات البيوفيلمية البكتيرية أمر بالغ الأهمية لاختيار المركبات الفعالة للقضاء على العدوى عندما تتشكل على البلاستيك الطبي (على سبيل المثال ، القسطرة الساكنة) والغرسات الطبية. تقوم أسرع طرق استزراع مضادات الميكروبات في المختبر بفحص نمو الأغشية الحيوية كثقافة بيوفيلم “ثابتة” بدلا من الثقافات “المستمرة” ، حيث يتم رصد نمو البكتيريا الثابتة في المراحل المبكرة إلى المتأخرة من تكوين الأغشية الحيوية على مدى إطار زمني قصير (24-96 ساعة) في نفس وسط النمو. تعتبر طرق الأغشية الحيوية المستمرة مرهقة للتحليل السريع لأنها تتطلب تقييم نمو الأغشية الحيوية على مدى أطر زمنية أطول نمت في غرف تسمح بالتدفق المستمر واستبدال وسائط النمو بعدد أقل من النسخ المتماثلة11. نظرا للوقت والجهد اللازمين للحفاظ على الأغشية الحيوية المستمرة وإنشائها ، فإن الأغشية الحيوية الثابتة في المختبر هي الأكثر شعبية ، حيث يتم تكييفها بسهولة لاختبارات اختبار الحساسية المضادة للميكروبات عالية الإنتاجية في ألواح ميكروتيتر بلاستيكية 96 بئرا بدلا من أنظمة غرفة التدفق المفصلة التي تحد من عدد الثقافات التي تم اختبارها في وقت واحد 12,13 . تستخدم أبسط مقايسات الصفائح الدقيقة الأغشية الحيوية الثابتة “في البئر” ألواح ميكروتيتر قياسية من البوليسترين أو الفينيل (سعة 300 ميكرولتر) لقياس تكوين الأغشية الحيوية على جانبي وقيعان كل بئر وغالبا ما تكون حلقات في واجهة السطح من الهواء إلى السطح السائل. يتم قياس تكوين الأغشية الحيوية البكتيرية داخل البئر عن طريق تلطيخ الكتلة الحيوية المترسبة الملتصقة بالآبار بعد إزالة السائل متوسط النمو وغسل الأغشية الحيوية12,13. هذه الفحوصات شائعة اقتصاديا ولكن غالبا ما يكون لها مشاكل في التكاثر بسبب تصميمها المتأصل ، حيث أن الأغشية الحيوية المودعة عرضة للتلف أو الخسارة أثناء الشطف لاستعادة الخلايا وإجراءات تلطيخ الكتلة الحيوية 11,14.

للحد من خسائر البيوفيلم ، قامت أجهزة البيوفيلم التجارية القياسية بتحسين تصميمات الألواح الدقيقة البيوفيلم في البئر عن طريق إضافة غطاء بوليسترين قابل للإدخال ب 96 بئرا إلى تصميم لوحة 96 القياسي في البئر ، والذي يشار إليه باسم “جهاز البيوفيلم القياسي” هنا. تعمل إضافة غطاء مربوط على توسيع مساحة السطح المتاحة في كل بئر ميكروبليت ، مما يسمح بتعزيز التصاق السطح وتكوين الكتلة الحيوية الأغشية الحيوية15,16. تسمح أجهزة الغطاء البيوفيلم المربوطة القياسية باستعادة الأغشية الحيوية وإزالتها وشطفها بشكل أكبر لاختبار قابلية الأغشية الحيوية المضادة للميكروبات اللاحقة والقضاء عليها عند إدخال أغطية مربوطة في ألواح ميكروتيتر جديدة تحتوي على تحديات في حالة الدواء أو النمو. على غرار تقنيات الألواح الدقيقة البيوفيلم في البئر ، تسمح المواد المستردة من أجهزة الغطاء المربوطة التي تمت إزالتها وغسلها باختبار بقاء الخلايا وتلطيخ الكتلة الحيوية للأغشية الحيوية ، والتي تتضمن عادة تركيبات صبغة الكريستال البنفسجي (CV) 17،18،19. أجهزة الأغشية الحيوية القياسية هي أيضا الأمثل لعرض حساسية البيوفيلم المضادة للميكروبات. تراقب هذه الفحوصات تثبيط نمو الأغشية الحيوية بطريقتين: 1) عندما تضاف مضادات الميكروبات إلى الخلايا في بداية النمو ، يمكنها تحديد الحد الأدنى لقيمة تركيز تثبيط الأغشية الحيوية (MBIC). 2) عندما تتشكل الأغشية الحيوية الراسخة على الأوتاد بعد 24 ساعة ثم تتعرض لمضادات الميكروبات ، يمكنها تحديد الحد الأدنى لتركيز استئصال الأغشية الحيوية (MBEC) بقيمة 17,20. على غرار أجهزة الصفائح الدقيقة البيوفيلم في البئر ، فإن أجهزة الأغشية الحيوية القياسية لها بعض القيود الملحوظة ، مثل تكلفتها العالية لكل جهاز ، فهي غير قابلة للتعقيم ، وأقل متانة للمذيبات الكيميائية بسبب مادة لوحة البوليسترين المستخدمة. تحتوي أجهزة البيوفيلم القياسية أيضا على نسبة منخفضة من مساحة السطح إلى الربط ، مما يحد من الحد الأقصى لأحجام العمل في كل بئر إلى 200 ميكرولتر. هذه العوامل يمكن أن تجعل أجهزة البيوفيلم القياسية أكثر صعوبة في استخدامها للدراسات التي تتطلب كميات أكبر من البيوفيلم في شكل عالي الإنتاجية.

هنا ، نصف طريقة ثابتة ذات غطاء مربوط بالأغشية الحيوية 96 بئرا تم تطويرها في مختبرنا باستخدام ألواح البولي بروبيلين شبه المنورة المتوفرة تجاريا بسعة 0.5 مل 96 بئرا PCR المثبتة على ألواح microtiter ذات 96 بئرا لها آبار أعمق من اللوحة القياسية (جدول المواد). يبلغ الحد الأقصى لحجم عمل هذه الأجهزة المجمعة 750 ميكرولتر عند استخدامها لزراعة الأغشية الحيوية (المعروفة هنا باسم “جهاز البيوفيلم العميق للبئر”). تتمثل مزايا استخدام أجهزة الأغشية الحيوية العميقة هذه في انخفاض تكلفتها عند مقارنتها بأجهزة البيوفيلم القياسية ، ويمكن تعقيمها عن طريق التعقيم ، كما أنها تزيد من مساحة السطح لتشكيل الأغشية الحيوية على “أنبوب / أوتاد” لوحة PCR الخارجية الأكبر. باستخدام هذه الطريقة ، نعرض تطبيقات هذه الأجهزة لزراعة وتوصيف الكتلة الحيوية الأغشية الحيوية التي شكلتها الإشريكية القولونية BW25113 و P. aeruginosa PAO1. يتم وصف طرق تحديد قيم MBEC باستخدام مقايسات استئصال الأغشية الحيوية باستخدام مضادات الميكروبات المطهرة بمركب الأمونيوم الأمونيوم الرباعي (BZK) ومضادات الميكروبات هيبوكلوريت الصوديوم (التبييض). تم اختيار BZK المطهر / المطهر لأن هذا المركب يستخدم بشكل متكرر لتثبيط الأغشية الحيوية من الأسطح الملوثة ، ولكن يقال إنه أقل فعالية في القضاء على الأغشية الحيوية الراسخة 21. التبييض هو مادة كيميائية فعالة للغاية للقضاء على الأغشية الحيوية المعمول بها وهو الدعامة الأساسية في التطهير الكيميائي 22. يوفر كلا المطهرين مقارنة مفيدة لقيم MBEC لكل جهاز بيوفيلم21. يتم تلخيص بروتوكول لتقييم جهاز البيوفيلم هذا باستخدام تلطيخ السيرة الذاتية واختبارات استئصال الأغشية الحيوية لتحديد MBEC في هذه المقالة. تم تضمين مخطط انسيابي للبروتوكول للحصول على نظرة عامة مبسطة لسير العمل لهذه الأساليب (الشكل 1).

Protocol

1. إعداد الثقافة المعقمة لنمو الأغشية الحيوية (الأيام 0-1) في اليوم 0 ، قم بربط السلالة (السلالات) البكتيرية المطلوبة للاختبار من مخزون محفوظ بالتبريد (في الجلسرين أو ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)) مباشرة على صفيحة أجار مغذية مع اختيار مضاد للميكروبات حسب ما تتطلبه السلالة. احتضان ألواح أجار عند درجة الحرارة المثلى (37 درجة مئوية) والوقت (18-22 ساعة) لنمو الإجهاد. في اليوم التالي (اليوم 1) ، قم بتلقيح مستعمرة من صفيحة الأجار في 5 مل من وسائط النمو في ظروف النمو المثلى. وستستخدم هذه الثقافات كتطعيمات لليوم الثاني لأجهزة الأغشية الحيوية (انظر الخطوة 2-2؛ الشكل 1).ملاحظة: بالنسبة لهذه الدراسة ، تم زراعة E. coli K-12 BW21153 و P. aeruginosa PAO1 في وسط Luria-Bertani (LB) عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة مع اهتزاز عند 160 دورة في الدقيقة (دورة في الدقيقة). قم بإعداد ما لا يقل عن 3 سلالات مستزرعة بشكل مستقل لتوليد نسخ بيولوجية لقياس الأغشية الحيوية بسبب التباين الإحصائي لتشكيل الكتلة الحيوية للأغشية الحيوية على أجهزة الغطاء المربوط. 2. إعداد وتلقيح اللوحات (اليوم الثاني) املأ الآبار الخارجية لصفيحة بولي بروبيلين معقمة من 96 بئرا و 1.1 مل / بئر ب 750 ميكرولتر / بئر مياه معقمة (الشكل 2 أ). املأ آبار التحكم السلبية (آبار الوسائط غير الملقحة ؛ العمود B) بوسائط نمو 750 ميكرولتر والآبار المتبقية بوسائط نمو 675 ميكرولتر.ملاحظة: الخطوة 2.1 أعلاه والخطوات أدناه قائمة وحدات التخزين المناسبة لجهاز بيوفيلم البئر العميق. في حالة استخدام جهاز البيوفيلم القياسي ، يجب تغيير الأحجام على النحو التالي: 75 ميكرولتر من زراعة التلقيح إلى 20 ميكرولتر. 675 ميكرولتر من وسائط النمو إلى 180 ميكرولتر ؛ 750 ميكرولتر من الماء المعقم / وسائط النمو إلى 200 ميكرولتر ؛ 800 ميكرولتر من محاليل البقع / حمض الخليك / الشطف CV إلى 210 ميكرولتر. بالإضافة إلى ذلك ، بالنسبة للخطوة 3.6 أدناه ، يمكن قراءة الامتصاص عند 500 نانومتر (A550 نانومتر) مباشرة في صفيحة البوليسترين الدقيقة بعد الخلط عند استخدام لوحة جهاز البيوفيلم القياسية. باستخدام ثقافات اليوم الأول بين عشية وضحاها، قم بتوحيد الثقافات إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر (OD600nm) = 1.0 أو إلى معيار ماكفارلاند من 0.5-1 وحدة. قم بإنشاء تخفيف تسلسلي 10 أضعاف لكل ثقافة قياسية في أنابيب اختبار أو لوحة ميكروتيتر بئر عميقة 96 بئرا حتى يتم الوصول إلى تخفيف 10-3 . قم بتلقيح الوسائط التي تحتوي على آبار كما هو موضح في الشكل 2B ب 75 ميكرولتر من المستنبتة المخففة 1 × 10-3 ، للحصول على تخفيف بكتيري نهائي في البئر من 10-4. أدخل بعناية صفيحة PCR معقمة (غطاء مربوط) في صفيحة البئر العميقة الملقحة. احتضان الألواح في ظروف الإجهاد المثلى (37 درجة مئوية) مع الاهتزاز (بحد أقصى 160 دورة في الدقيقة) في حاضنة ذات رطوبة 50-60٪ لمدة 24 ساعة. 3. تحديد الكتلة الحيوية للفيلم الحيوي من الأجهزة التي تستخدم تلطيخ السيرة الذاتية (اليوم 3) قم بإزالة الغطاء المربوط بالأغشية الحيوية من كل جهاز وشطفه عن طريق إدخاله في صفيحة بئر عميقة معقمة محضرة ب 800 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات المعقم (PBS) / بئر لمدة 30 ثانية لإزالة الخلايا العوالقية. لتلطيخ CV بالكتلة الحيوية ، انقل غطاء لوحة PCR المربوط إلى لوحة جديدة محضرة ب 800 ميكرولتر / بئر 0.1٪ (w / v) CV في dH2O ووصمة عار لمدة 5 دقائق. قم بإزالة البقعة الزائدة عن طريق شطف الغطاء المربوط في صفيحة بئر عميقة محضرة ب 800 ميكرولتر / PBS معقمة جيدا. اترك الألواح لتجف لمدة 10 دقائق في خزانة السلامة البيولوجية مع أوتاد متجهة لأعلى. انقل غطاء لوحة PCR المجفف إلى صفيحة تحتوي على 800 ميكرولتر / بئر 30٪ (v / v) حمض الخليك واترك الغطاء يزيل البقع لمدة 5 دقائق. قم بإزالة غطاء ربط PCR غير الملطخ واخلط المحلول جيدا عن طريق السحب. انقل 200 ميكرولتر من ألواح البئر العميقة إلى صفيحة ميكروبليت قياسية من 96 بئرا وقم بقياس امتصاص محلول إزالة التلطيخ بطول موجي يبلغ 550 نانومتر (A550nm) في قارئ ميكروبليت بالأشعة فوق البنفسجية (UV) / مرئي (Vis). باستخدام قيم A550nm المقاسة، اطرح متوسط قيمة A550nm الفارغة (عنصر التحكم السالب) من كل قيمة عينة بيوفيلم. متوسط كل قيمة عينة من الأغشية الحيوية A550nm مطروحة فارغة تمثل النسخ المتماثلة البيولوجية للعينة. 4. تحدي الأغشية الحيوية مع مضادات الميكروبات لحساب قيمة MBEC المضادة للميكروبات على مدار 24 ساعة (اليوم 3) تحضير محلول مخزون مضاد للميكروبات في الماء يكون ضعف (2x) تركيز أعلى تركيز مضاد للميكروبات المطلوب اختباره. إنشاء سلسلة تخفيف مزدوجة من محلول المخزون المضاد للميكروبات في وسائط نمو مركزة 2x بحيث يكون هناك 8 تركيزات مضادة للميكروبات. كما هو موضح في الشكل 2 ب ، املأ الآبار الخارجية لصفيحة بئر عميقة معقمة معقمة ب 750 ميكرولتر / بئر. املأ الأعمدة B (التحكم السلبي ؛ لا توجد بكتيريا) و C (التحكم الإيجابي ؛ عدم التعرض لمضادات الميكروبات) من الصفيحة بوسائط نمو 750 ميكرولتر / بئر. املأ الآبار المتبقية ب 750 ميكرولتر/بئر من سلسلة التخفيف المضادة للميكروبات كما هو مبين في الشكل 2 ب. قم بإزالة وشطف الغطاء المربوط كما هو موضح في الخطوة 3.1 ونقله إلى لوحة التحدي المضادة للميكروبات. احتضان الألواح مع الاهتزاز (بحد أقصى 160 دورة في الدقيقة) في ظروف الإجهاد المناسبة والإطار الزمني المطلوب للتعرض. 5. استعادة الكتلة الحيوية الأغشية الحيوية من الأغطية المربوطة (اليوم 4) قم بإزالة الأغطية المربوطة المكشوفة المضادة للميكروبات وشطفها كما هو موضح في الخطوة 3.1. انقل الغطاء المربوط إلى صفيحة بئر عميقة مع وسائط استرداد 750 ميكرولتر / بئر في الآبار الداخلية و 750 ميكرولتر / بئر معقمة dH2O في الآبار الخارجية. لإعداد وسائط استرداد 70 مل ، اجمع بين 35 مل من 2x LB المركز ، و 0.7 مل من 100٪ tween-20 ، و 3.5 مل من محلول تحييد عالمي 20x ، و 30.8 مل من dH2O المعقم في زجاجة معقمة. لتحضير محلول تحييد عالمي مركز 20x ، أضف 1.0 جم من L-histidine و 1.0 جم من L-cysteine و 2.0 جم من الجلوتاثيون المنخفض إلى حجم نهائي قدره 20 مل من dH2O. قم بتعقيم المرشح من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر وتخزينه عند 4 درجات مئوية. ضع الجهاز من الخطوة 5.1 في صندوق ثانوي مثبت داخل حمام مائي صوتني. قم بسونيك الأجهزة لمدة 30 دقيقة لإزاحة البيوفيلم من الأوتاد إلى وسائط الاسترداد. بعد الصوتنة ، قم بإزالة الغطاء المربوط ووضع غطاء غطاء لوحة مسطحة معقمة على لوحة وسائط استعادة البئر العميقة. يمكن التخلص من الغطاء المربوط. احتضان الألواح مع وسائط الاسترداد من الخطوة 5.3 في ظروف نمو الإجهاد المثلى بين عشية وضحاها (16-18 ساعة). 6. تحديد قيم MBEC للجهاز (اليوم 5) في اليوم التالي ، انقل 200 ميكرولتر من كل بئر من صفيحة البئر العميقة المحتضنة من الخطوة 5.4 إلى لوحة ميكروتيتر جديدة من 96 بئرا. اقرأ OD600nm لكل بئر باستخدام قارئ microplate من الأشعة فوق البنفسجية / Vis. اطرح قيم OD600nm للتحكم السالب (الفارغ غير الملقح) من كل فيلم حيوي يحتوي على عينة بشكل جيد. احسب قيمة MBEC لكل عينة باستخدام قيم OD600nm ، حيث تكون قيمة MBEC هي أدنى تركيز مضاد للميكروبات أدى إلى أدنى قيمة OD600nm (لا يمكن تمييزها عن التحكم غير الملقح) لعينة معينة من الأنواع / السلالات المعالجة بمضادات الميكروبات.

Representative Results

كان الهدف من هذه الدراسة هو توفير طريقة لإجراء قياسات أكبر حجما وإنتاجية عالية (96 بئرا) وجهاز بيوفيلم ثابت باستخدام أجهزة الأغشية الحيوية العميقة للآبار. هنا ، قارنا لوحة PCR نصف التنانير ذاتية التجميع التي تم إدخالها في صفيحة بئر عميقة ، والمعروفة باسم جهاز البئر العميق ، بجهاز غطاء بيوفيلم مرتبط قياسي شائع الاستخدام لفحص قدراتها على تكوين أغشية حيوية ثابتة. تم استخدام مقايسات الكتلة الحيوية الملطخة بالسيرة الذاتية واستئصال الأغشية الحيوية (MBEC) لتقييم تكوين الأغشية الحيوية بواسطة كلا الجهازين. لمقارنة تكوين الأغشية الحيوية حسب الأنواع المختلفة على كل جهاز، قمنا بتقييم الكتل الحيوية للأغشية الحيوية التي شكلتها E. coli BW25113 و P. aeruginosa PAO1 باستخدام بروتوكول تلطيخ السيرة الذاتية البيوفيلم17. على الرغم من أن تلطيخ السيرة الذاتية يتم الإبلاغ عنه بشكل عام كقيم A550nm ، نظرا للاختلافات في أحجام النمو لكل جهاز ومناطق سطحه المتاحة ، قمنا بتحويل قيم بقع CV A550nm إلى تركيزات CV المولية في المحلول. وتمثل تركيزات CV المولية اختلافات الحجم لكل جهاز وتسمح بمقارنة تركيزات CV التي تمثل الكتل الحيوية المستردة من كل جهاز. أظهرت النتائج أن كلا النوعين أنتجا كتلة حيوية أكبر بكثير على أجهزة الأغشية الحيوية للآبار العميقة (2.1 ضعف E. coli ؛ 4.1 أضعاف P. aeruginosa) مقارنة بجهاز الأغشية الحيوية القياسي (الشكل 3A-B)”. كانت هذه النتيجة متوقعة بالنظر إلى المساحة السطحية الأكبر لربط PCR العميق للبئر (320.4 مم 2) مقارنة بمساحة سطح ربط الجهاز القياسية (108.9 مم 2). وتتفق هذه النتيجة أيضا مع زيادة الأحجام المتزايدة (750 ميكرولتر) المستخدمة في جهاز الأغشية الحيوية للآبار العميقة مقارنة بآبار الجهاز القياسية (200 ميكرولتر). وبالتالي ، زادت أجهزة الآبار العميقة من تراكم الكتلة الحيوية للأغشية الحيوية على أوتاد أنبوب PCR مقارنة بالأوتاد الأصغر حجما مع أجهزة الأغشية الحيوية القياسية. شكل كلا الجهازين البيوفيلم أغشية حيوية قابلة للتكرار عندما قارنا الأغشية الحيوية المكررة بيولوجيا التي شكلتها E. coli و P. aeruginosa (الشكل 3A-B). على الرغم من ملاحظة تباين أكبر في قيم M A550nm الملطخة بالسيرة الذاتية للتكرار التقني لأي من السلالات المزروعة على جهاز البئر العميق ، لم تكن هناك اختلافات ذات دلالة إحصائية عند مقارنة قيم CV M المتوسطة للتكرارات البيولوجية لكل نوع على البئر العميق أو الأجهزة القياسية باستخدام التحليل الثنائي ثنائي الاتجاه للتباين (ANOVA) أو اختبارات T للطالب (كلاهما p > 0.05). تظهر هذه النتيجة أن تكوين الأغشية الحيوية بواسطة الآبار العميقة والأجهزة القياسية تشكل أغشية حيوية قابلة للتكرار. ومع ذلك ، أظهرت نتائج تلطيخ السيرة الذاتية أيضا أنه عندما قمنا بحساب الاختلافات في مساحة سطح الربط على كل جهاز ، أظهر تكوين الكتلة الحيوية للأغشية الحيوية بواسطة E. coli و P. aeruginosa اختلافات ذات دلالة إحصائية في تراكم الكتلة الحيوية (الجدول 1). أظهر حساب متوسط الكتلة الحيوية الملطخة بالسيرة الذاتية (M) لكل مساحة سطح ربط في mm2 (CV M/mm2) للإشريكية القولونية أن تكوين الأغشية الحيوية كان أقل بمقدار 1.5 مرة على أجهزة الآبار العميقة المصنوعة من البولي بروبيلين عند مقارنته بجهاز الأغشية الحيوية القياسي (الجدول 1). ومع ذلك ، تم الحصول على النتيجة المعاكسة ل P. aeruginosa ، والتي أظهرت 1.4 ضعف CV M / mm2 أعلى على أجهزة الآبار العميقة البولي بروبيلين عند مقارنتها بأجهزة الأغشية الحيوية القياسية (الجدول 1). وعلى الرغم من الاختلافات الملحوظة الخاصة بالأنواع في تراكم الكتلة الحيوية للأغشية الحيوية مع كل جهاز، فإن جهاز البئر العميق لا يزال يظهر زيادة في تكوين الكتلة الحيوية للأغشية الحيوية بشكل عام (2-4 أضعاف) من قبل كل نوع (الشكل 3). لتحديد تطبيقات اختبار القابلية لمضادات الميكروبات لجهاز الأغشية الحيوية للبئر العميقة ، قارنا اثنين من المطهرات شائعة الاستخدام ، BZK و bleach ، لإمكاناتهما في القضاء على الأغشية الحيوية. تستخدم كلتا المادتين الكيميائيتين بشكل شائع لمنع (BZK) و / أو القضاء على الأغشية الحيوية البكتيرية (المبيضة) في التطبيقات السريرية والصناعية21،22،23. تمت إضافة كل مركب في زيادة تركيزات 2 أضعاف إلى الأغشية الحيوية التي شكلتها E. coli و P. aeruginosa على أجهزة الأغشية الحيوية القياسية والعميقة للبئر 22,23 (الأشكال 1 ، 2B). تم تعريف أدنى تركيز من BZK أو التبييض الذي أدى إلى قيم OD600nm التي لا يمكن تمييزها عن آبار التحكم السلبية على أنها قيمة MBEC. أدت معالجة الأغشية الحيوية التي تشكلت على أجهزة الأغشية الحيوية القياسية مع التبييض إلى نفس قيم MBEC المبيض بنسبة 0.625٪ ل E. coli و P. aeruginosa (الجدول 1 ، الشكل 4A-B). أظهرت قيم MBEC المبيضة المحددة للأغشية الحيوية E. coli و P. aeruginosa التي تشكلت على أجهزة الآبار العميقة 2-4 أضعاف قيم MBEC أقل من كلا النوعين (E. coli ؛ 0.156٪; P. aeruginosa 0.313٪ بالمقارنة مع الأجهزة القياسية (الجدول 1). ولوحظ وجود اختلاف بمقدار ضعفين في قيم التبييض MBEC بين الأنواع لجهاز البئر العميق، حيث تتطلب P. aeruginosa تركيزا أعلى بمقدار ضعفين من المبيض للقضاء على الأغشية الحيوية مقارنة بالإشريكية القولونية (الشكل 4A-B، الجدول 1). يبدو أن فرق MBEC المبيض 2 أضعاف بين P. aeruginosa و E. coli في جهاز الآبار العميقة يرتبط عكسيا بزيادة تكوين الكتلة الحيوية الملطخة بالسيرة الذاتية بمقدار 1.5 ضعف بواسطة P. aeruginosa مقارنة ب E. coli (الشكل 3A-B). وقد تفسر الكمية الأكبر من الكتلة الأحيائية التي شكلتها المتصورة بواسطة المتصورة الزنجارية على أوتاد أجهزة الآبار العميقة أيضا سبب الحاجة إلى تركيز تبييض أعلى للقضاء على الأغشية الحيوية للبكتيريا P. aeruginosa عند مقارنتها بالإشريكية القولونية في الآبار العميقة (الشكل 3A-B، الجدول 1). وبالتالي ، تظهر اختبارات استئصال الأغشية الحيوية لجهاز الآبار العميقة أن كلا النوعين كانا عرضة للتبييض ولكن بتركيزات تبييض أقل (2-4 أضعاف) مقارنة بالأجهزة القياسية. يرتبط هذا عكسيا بمساحة سطح الوتد الأكبر بمقدار 3 أضعاف وأحجام أوتاد لوحة PCR لجهاز البئر العميق. وهذا يشير إلى أنه بالنسبة للتعرض للتبييض، فإن زيادة مساحة سطح الكتلة الحيوية قد يقلل من تركيزات التبييض اللازمة للقضاء على الأغشية الحيوية. أظهر اختبار استئصال الأغشية الحيوية BZK تباينا أكبر في النمو المسترد (قيم OD600nm) وقيم MBEC حسب كل نوع عند مقارنته بنتائج التبييض (الشكل 4C-D). هذا التباين ليس غير متوقع استنادا إلى الدراسات السابقة التي تظهر أن BZK كان أكثر فعالية في منع تكوين الأغشية الحيوية من القضاء على الأغشية الحيوية الراسخة24،25،26. باستخدام جهاز البيوفيلم القياسي ، أظهرت الأغشية الحيوية P. aeruginosa المعالجة ب BZK فقط قيمة MBEC متسقة (2560 ميكروغرام / مل) كانت أقل ب 8 أضعاف من قيمة MBEC (20480 ميكروغرام / مل) التي تم الحصول عليها لهذه السلالة في جهاز البئر العميق (الجدول 1 ، الشكل 4C). قد تعكس هذه النتائج الاختلافات في كميات الكتلة الحيوية P. aeruginosa التي تشكلت على الأسطح العميقة المربوطة جيدا والتركيبات البلاستيكية عند مقارنتها بأوتاد الجهاز القياسية. كان استئصال BZK للأغشية الحيوية التي شكلتها الإشريكية القولونية على كل من البئر العميق والأجهزة القياسية ضعيفا بنفس القدر ، مما أدى إلى مجموعة واسعة من قيم BZK MBEC من 2560-40960 ميكروغرام / مل لجهاز البئر العميق و 320-10240 ميكروغرام / مل على الجهاز القياسي (الشكل 4D). وبالنسبة للإشريكية القولونية، تم تفسير هذا التباين من خلال الحالة العرضية التي أظهرت فيها 1-2 آبار مكررة نموا منخفضا ولكنه ذو دلالة إحصائية في وسائط الاسترداد، مما زاد من الخطأ وقلل من دقة تحديد BZK MBEC مع أي من الجهازين (الشكل 4D، الجدول 1). يسلط هذا التباين الضوء على عدم فعالية استخدام BZK في القضاء على الأغشية الحيوية للإشريكية القولونية كما لوحظ سابقا في الدراسات24،25،26. وعلى النقيض من ذلك، يمكن القضاء على الأغشية الحيوية P. aeruginosa بشكل موثوق بواسطة BZK بتركيز محدد مع كلا الجهازين، ولكن مع اختلاف تركيز BZK 8 أضعاف (الشكل 4C). باختصار ، تظهر قيم MBEC للقضاء على BZK للأغشية الحيوية التي شكلتها P. aeruginosa قيم MBEC متميزة مع كل جهاز ، ومع ذلك ، فإن كلا الجهازين ضعيفان بنفس القدر في التمييز بين الأنماط الظاهرية الدقيقة للقضاء على الإشريكية القولونية BZK. وبالتالي ، فإن طريقة جهاز البيوفيلم العميق للبئر الموصوفة هنا فعالة بالمثل لتشكيل الأغشية الحيوية القابلة للتكرار عند مقارنتها بجهاز البيوفيلم القياسي .. الشكل 1. نظرة عامة تخطيطية على التجربة. يوم 0 عزل المستعمرات المفردة عن المخزون المحفوظ بالتجميد ؛ اليوم 1 تلقيح وسائط النمو مع مستعمرات واحدة ؛ اليوم 2 تلقيح لوحة البيوفيلم ؛ اليوم 3 تلطيخ السيرة الذاتية أو التحدي المضاد للميكروبات. اليوم 4 صوتنة البيوفيلم في وسائط الانتعاش. واليوم 5 قراءة OD600nm من لوحة الاسترداد لتحديد قيم MBEC. بعض الصور في الشكل المقدمة من سيرفييه ميديكال آرت (smart.servier.com). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2. مثال على تخطيطات اللوحة الموضحة لخطوات مختلفة من البروتوكول. أ ) إعداد اللوحة النهائي لنمو الأغشية الحيوية الأولي على مدار 24 ساعة باستخدام الثقافات البكتيرية في اليوم 1 من سلالتين بكتيريتين (E. coli و P. aeruginosa) ، لكل منهما ثلاثة نسخ بيولوجية. تستخدم آبار التحكم السلبية (الرمادية) كضوابط للعقم (بدون إضافة بكتيريا). ب) إعداد لوحة للتحدي المضاد للميكروبات من الأغشية الحيوية. تشير الألوان الداكنة إلى زيادة تركيز مضادات الميكروبات. السيطرة السلبية هي الآبار التي لا تحتوي على بكتيريا مضافة (رمادية) والضوابط الإيجابية هي الأغشية الحيوية مع عدم التعرض لمضادات الميكروبات (برتقالي). يتم نقل أغطية ربط الأغشية الحيوية المأخوذة من اللوحة A إلى صفيحة البئر العميقة هذه للتعرض لمضادات الميكروبات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3. التركيز المولي (M) من E. coli BW25113 الملطخ بالسيرة الذاتية. (A) و P. aeruginosa PAO1 (B) الكتلة الحيوية الأغشية الحيوية المستردة من الأجهزة القياسية (الدوائر) وأجهزة الآبار العميقة (المثلثات). تم قياس تلطيخ السيرة الذاتية من خلال قراءة امتصاص CV عند 550 نانومتر (A550nm) ، وتم تعديل قراءات البئر العميقة A550nm بعامل 3.809 (800 ميكرولتر / 210 ميكرولتر) لحساب اختلافات الحجم بين الأجهزة. تم تحديد التركيز المولي CV (M) بواسطة قانون بير لامبرت (تركيز CV = A550nm / εl) ؛ حيث تم تحديد طول المسار (l) البالغ 210 ميكرولتر في لوحة microtitre ذات القاع المسطح 96 على أنه 0.56 سم ومعامل الانقراض (ε) CV في الماء عند A550nm من 251500 cm-1M-139. تمثل النتائج 9 نسخ متماثلة تقنية من ثلاث نسخ بيولوجية لكل سلالة نمت كفيلم حيوي وتظهر القيمة الوسيطة لكل نسخة بيولوجية كشريط أفقي في كل مخطط. تم تحديد الفروق ذات الدلالة الإحصائية في الكتلة الحيوية بين الأجهزة بين القيم الوسيطة للتكرار البيولوجي باستخدام اختبار t المقترن ثنائي الذيل (E. coli p= 0.008-0.018 (*); P. aeruginosa p= 0.002-0.009 (**)) تظهر كأشرطة ذات علامات نجمية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.  الشكل 4. تحديد تركيز MBEC المضاد للميكروبات. تحديد تركيز MBEC المضاد للميكروبات للتبييض (A ، B) و BZK (C ، D) ل P. aeruginosa PAO1 (A ، C) و E. coli BW25113 (B ، D) عند زراعتها على أجهزة ربط الأغشية الحيوية القياسية (القضبان البيضاء) والبئر العميقة (القضبان الرمادية). تم تحديد النتائج من خلال قراءة OD600nm من الأغشية الحيوية المستردة بعد الصوتنة في وسائط الاسترداد والحضانة بين عشية وضحاها. تم تعديل البئر العميق OD600nm بعامل 3.75 (750 ميكرولتر / 210 ميكرولتر) لحساب اختلافات الحجم بين الأجهزة. وتمثل النتائج ثلاثة تكرارات بيولوجية وتظهر أشرطة الخطأ الانحراف المعياري بين النسخ المتماثلة عند كل تركيز مضاد للميكروبات39. تشير العلامات النجمية (*) فوق كل مخطط شريط إلى اختلافات ذات دلالة إحصائية في قيم OD600nm من عناصر التحكم الفارغة مع قيم p < 0.05 باستخدام حسابات اختبار T للطالب ذات الذيلين. تشير رموز الدائرة (o) فوق كل مخطط شريط إلى القياسات التي تحتوي فيها 1 أو 2 نسخة متماثلة فقط على قيم OD600nm ذات دلالة إحصائية من عناصر التحكم الفارغة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. BZK MBEC (ميكروغرام / مل) التبييض MBEC (٪ v / v) اختبار الإجهاد جهاز البئر العميق جهاز قياسي جهاز البئر العميق جهاز قياسي الإشريكية القولونية BW25113 2560-40960 320-10240 0.156 0.625 P. aeruginosa باو1 20480 2560 0.313 0.625 جهاز البئر العميق جهاز قياسي p-value** تغيير الطي (بئر عميق / قياسي) اختبار الإجهاد متوسط السيرة الذاتية M * / mm2 ± SD متوسط السيرة الذاتية M * / mm2 ± SD الإشريكية القولونية BW25113 1.99 × 10-8 ± 3.25 × 10-9 3.03 × 10-8 ± 3.31 × 10-9 0.0176 -1.52 P. aeruginosa باو1 8.01 × 10-8 ± 9.42 × 10-9 5.72 × 10-8 ± 9.42 × 10-9 0.034 1.4 الجدول 1. ملخص ل E. coli BW25113 و P. aeruginosa PAO1 يعني قيم الكتلة الحيوية M/mm2 الملطخة بالسيرة الذاتية وقيم MBEC للقضاء على الأغشية الحيوية ل BZK والتبييض على أجهزة مختلفة.* متوسط قيم CV M / mm2 المحسوبة باستخدام قيم CV M المتماثلة بيولوجيا المتوسطة (الشكل 3).** تم تحديد قيم p باستخدام اختبار T للطالب ثنائي الذيل.

Discussion

تصف هذه الدراسة طرق استخدام جهاز نمو الأغشية الحيوية الثابت ذي الإنتاجية العالية الأكبر حجما والبالغ 96 بئرا والذي يتضمن صفيحة دقيقة عميقة من البولي بروبيلين مزودة بغطاء صفيحة PCR شبه منفوخ لتشكيل الأغشية الحيوية (جهاز الأغشية الحيوية للبئر العميقة; جدول المواد). قارنا الأغشية الحيوية التي تم إنشاؤها باستخدام هذا الجهاز بجهاز البيوفيلم القياسي المتاح تجاريا من البوليسترين (جدول المواد). تستخدم طريقة جهاز البئر العميق نفس الخطوات والحلول المنهجية التي يستخدمها الجهاز القياسي17 عند الأحجام المعدلة المعدلة لأجهزة الآبار العميقة، مما يجعل هذا الجهاز مثاليا لتشكيل الأغشية الحيوية على نطاق واسع والتحليل التجريبي. تم فحص نمو E. coli BW25113 و P. aeruginosa PAO1 ، وهما نوعان سالبان الجرام معروفان بتكوين الأغشية الحيوية ، لتكوين الكتلة الحيوية وقيم MBEC المطهرة (BZK / التبييض) المستخدمة على كلا الجهازين. أظهرت مقارنة الكتلة الحيوية الملطخة بالسيرة الذاتية التي تشكلت على أوتاد من كل جهاز أن كلا من E. coli و P. aeruginosa شكلتا أغشية حيوية ذات كتلة حيوية أعلى على جهاز الأغشية الحيوية للبئر العميقة عند مقارنتها بالجهاز القياسي (الشكل 3A-B). عكست الكتلة الحيوية للأغشية الحيوية زيادة مساحة السطح الأكبر لأوتاد الآبار العميقة عند مقارنتها بمساحة سطح ربط الجهاز القياسية. عندما أخذنا في الاعتبار الاختلافات في مناطق سطح الربط (mm2) مع كلا الجهازين ، لوحظت اختلافات في تكوين الكتلة الحيوية ، حيث شكلت E. coli كتلة حيوية CV أكبر بكثير لكل mm2 على أوتاد الجهاز القياسية البوليسترين مقارنة بأوتاد أنبوب PCR لجهاز البئر العميق (الجدول 1). شكلت P. aeruginosa كتلة حيوية أكبر ملطخة بالسيرة الذاتية / ربط mm2 مقارنة بالأجهزة القياسية (الجدول 1). قد تسلط هذه النتائج الضوء على الاختلافات الخاصة بالأنواع في تكوين الكتلة الحيوية للأغشية الحيوية على الأجهزة المختلفة.

وتجدر الإشارة إلى أن استئصال المبيضات للأغشية الحيوية للإشريكية القولونية والمتصورة الزنجارية على أجهزة الآبار العميقة حدث بتركيزات أقل بمقدار 2-4 أضعاف من الجهاز القياسي (الشكل 4A-B، الجدول 1). من المحتمل أن تتأثر الاختلافات في قيم MBEC المبيضة المحددة من كل جهاز بالاختلافات في أشكال ربط الجهاز (“أوتاد” الآبار العميقة هي أنابيب مدببة والأوتاد القياسية أسطوانية) ، واختلافات التركيب البلاستيكي (البولي بروبيلين مقابل البوليسترين) ، والاختلافات في الحجم (750 ميكرولتر مقابل 200 ميكرولتر). على سبيل المثال، كان لدى P. aeruginosa كتلة حيوية CV M أكبر / mm2 على أوتاد أجهزة الآبار العميقة عند مقارنتها بالأجهزة القياسية ، ولكن E. coli كان لديه كتلة حيوية أقل على أوتاد الآبار العميقة (الشكل 3). وهذا يشير إلى أن تركيزات المطهرات اللازمة للقضاء على الأغشية الحيوية قد تتأثر بالكتلة الحيوية التي يشكلها كل نوع وكذلك المساحة السطحية المتاحة. بالإضافة إلى ذلك ، قد تؤثر الاختلافات في شكل ربط الجهاز على ظروف النمو المختلفة لأنواع معينة. في دراستنا ، قد تشكل P. aeruginosa كتلة حيوية أكبر على أوتاد الآبار العميقة بسبب مساحة سطحها الأكبر وتهويتها ، لأن هذا النوع هو هوائي ملزم على النقيض من الإشريكية القولونية ، وهو لاهوائي اختياري. حتى الآن ، لم نحدد أي دراسات منشورة قارنت مباشرة تكوين الأغشية الحيوية E. coli و P. aeruginosa معا على كل من مواد البولي بروبيلين 27،28،29 والبوليسترين 30،31. ومع ذلك ، فقد لوحظت تقارير عن تكوين قوي للأغشية الحيوية E. coli و P. aeruginosa في دراسات مستقلة تدرس إما مواد البولي بروبيلين أو البوليسترين. فيما يتعلق بالزائفة ، يمكن للعديد من Pseudomonas spp. استخدام البلاستيك مثل البولي بروبيلين كمصادر محتملة للكربون 32. وبالتالي ، فإن توافر جهاز الأغشية الحيوية العميقة للبئر من البولي بروبيلين هو تقدم مفيد في دراسات الأغشية الحيوية الثابتة. البولي بروبيلين أكثر متانة كيميائيا من البوليسترين وهو مادة ذات صلة سريريا ، حيث يتم استخدامه بشكل متكرر في الغرسات الطبية والغرز والشبكات لجراحات الفتق أو الحوض33,34.

على الرغم من أن الكتلة الحيوية للأغشية الحيوية تشكلت بواسطة كلا الجهازين ، إلا أن جهاز البئر العميق كان له تباين أعلى قليلا في الكتلة الحيوية استنادا إلى طريقة تلطيخ السيرة الذاتية وقيم MBEC لاستئصال الأغشية الحيوية OD600nm للتبييض و BZK. يمكن تفسير ذلك من خلال 3 عوامل رئيسية: 1) أجهزة الآبار العميقة لديها مساحة سطح ربط أكبر من الأجهزة القياسية التي كانت بزاوية مقارنة بأوتاد الأجهزة القياسية. 2) قد يكون لكلا النوعين اللذين تم اختبارهما قدرات مختلفة على الالتصاق بمواد البولي بروبلين والبوليسترين لكل جهاز. 3) تختلف أحجام وسائط النمو المستخدمة في كل جهاز (750 ميكرولتر عمق البئر ، 200 ميكرولتر قياسي) والتباعد بين الوتد المدرج إلى الجدران الجانبية للبئر. هذه المشكلات ليست مشكلة إذا تم استخدام نوع واحد فقط من الأجهزة لجميع تجارب البيوفيلم ، ومع ذلك ، إذا تم اختيار كلا الجهازين ، فيجب إجراء المقارنات التي أجريناها هنا لتحديد الاختلافات36,37. نظرا للاختلافات في المواد البلاستيكية المستخدمة في كل جهاز ، لا ينبغي مقارنة الكتلة الحيوية للأغشية الحيوية الملطخة بالسيرة الذاتية وقيم MBEC مباشرة بين الأجهزة المختلفة. ومع ذلك ، إذا أجريت الطرق والتجارب على نفس الجهاز (بئر عميق أو قياسي) ، فإن النتائج التي تم الحصول عليها للأنواع ومضادات الميكروبات التي تم اختبارها قابلة للمقارنة.

يوضح هذا البروتوكول أن أجهزة لوحة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) العميقة المجمعة ذاتيا هي جهاز بيوفيلم أكبر حجما لقياس تكوين الأغشية الحيوية والقضاء عليها وهو أيضا فعال من حيث التكلفة. من منظور التكلفة ، تتراوح أجهزة البيوفيلم القياسية ذات الأغطية المثبتة جيدا 96 بسعر يتراوح بين 29 و 36 دولارا أمريكيا لكل جهاز (جدول المواد). أجهزة البيوفيلم القياسية من البوليسترين ليست قابلة للتعقيم وهي أقل تحملا للمذيبات / الأحماض بسبب خصائصها الكيميائية البلاستيكية. تكلف ألواح الآبار العميقة المصنوعة من البولي بروبيلين ذاتية التجميع الموضحة هنا ، والمزودة بلوحة PCR منفصلة شبه منحرفة من 96 بئرا (جدول المواد) ما مجموعه 14 دولارا أمريكيا لكل جهاز مجمع ، وهو نصف تكلفة جهاز البيوفيلم القياسية. تجدر الإشارة إلى أن الأسعار قد تختلف اعتمادا على المنطقة والموزع والتوافر ، وتكاليفنا بعد الخصومات المؤسسية عملت إلى 9 دولارات أمريكية / جهاز البئر العميق. تتمتع هذه الأجهزة المصنوعة من البولي بروبيلين متعدد الكلور PCR المجمعة ذاتيا بميزة إضافية تتمثل في كونها قابلة للتعقيم للتعقيم وتوفر كتلة حيوية للأغشية الحيوية 2-4 مرات أكثر من الأجهزة القياسية.

في الختام ، يظهر هذا البروتوكول والنتائج التمثيلية من مقارنات نمو الأغشية الحيوية للبئر العميق وأجهزة الأغشية الحيوية القياسية أن كلا الجهازين قادران على زراعة الأغشية الحيوية البكتيرية ، لكن أجهزة الآبار العميقة تشكل 2-4 أضعاف البيوفيلم. يوفر جهاز الأغشية الحيوية للبئر العميقة بديلا قابلا للتطبيق وبأسعار معقولة لتجارب تكوين الأغشية الحيوية ذات الإنتاجية الكبيرة مثل دراسات فحص قابلية الأدوية. قد تولد هذه التقنية أغشية حيوية مفيدة لاستخراج “-omics” في المراحل النهائية (البروتيوميك ، الأيض ، النسخ) أو المقايسات التجريبية (الأنزيمية ، الفلورسنت) التي قد تتطلب كميات أكبر من مواد الأغشية الحيوية للتحليلات. يوصى باستخدام جهاز الأغشية الحيوية للبئر العميقة للمختبرات التي ترغب في دراسة الأغشية الحيوية في فحص 96 بئرا عالي الإنتاجية باستخدام مواد بلاستيكية أقل تكلفة وأكبر حجما ومتينة كيميائيا ذات صلة سريريا.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم توفير التمويل لهذا العمل من خلال منح التشغيل إلى DCB من منحة اكتشاف مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (RGPIN- 2016-05891) وإلى MRM و GRG من برنامج منحة الحكومة الكندية للبحث والتطوير في علم الجينوم (GRDI) (GRDI7 2254557).

Materials

10 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic (200/CS) Fisher Scientific 13-678-11F disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer
2 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic, 500/CS Fisher Scientific 13-678-11C disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer
Axygen Aerosol Filter Tips, Sterile, 5 racks/ PK, 1000 tips/rack Fisher Scientific 14-222-766 sterile pipettor tips for media aliquoting
Axygen deep well storage microplates, round wells, 1.1 mL cap, 5/PK, P-DW-11-C Fisher Scientific P-DW-11-C microplate for 96 well deepwell device biofilm cultivation
Axygen Filter tips, 350 µL tips racked, 96/rack, 10 racks, low retention barrier tips Fisher Scientific TF-350-L-R-S sterile pipettor tips for media aliquoting
Basin/reservoir natural PS 50 mL, Sterile, 5/bag, 40 bags, CS200 Avantor/ VWR 89094-676 sterile basins/ reservoirs for microplate preparation
BD Difco Dehydrated Culture Media: Granulated Agar, 500 g Fisher Scientific DF0145-17-0 materials for LB agar preparation
Biotek Synergy Neo2 multimode plate reader Biotek NEO2MB microplate UV/Vis region plate reader
Branson M3800 Ultrasonic Bath, 117 V Avantor/ VWR CPX-952-316R sonicating water bath
crystal violet (CV), ACS grade, 100 g Fisher Scientific C581-100 biofilm biomass stain
Dimethyl sulfoxide (DMSO), 1 L, ACS grade 99.9%, poly bottle, BDH Avantor/ VWR CABDH1115-1LP media components for cryopreservation
Easypet 3, pipet controller Avantor/ VWR CA11027-980 serological pipettor for aseptic media/ culture transfer
Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 10-100 µL Avantor/ VWR CA89125-338 multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer
Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 30-300 µL Avantor/ VWR CA89125-340 multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer
Glacial acetic acid, CAS 64-19-7, 2.5L, ACS grade Fisher Scientific A38-212 CV destain
Glass test tubes, 150 mm x 18 mm, 72/Pack, PYREX Fisher Scientific 14957H/ 9820-18 materials for cell culturing
Glycerol, 4 L glass bottle ACS Fisher Scientific BP229-4 media components for cryopreservation
L-Cysteine, 98%, 250 g Avantor/ VWR 97061-204 universal neutralizing solution
L-glutathione reduced, 98%, 25 g Fisher Scientific AAJ6216614 universal neutralizing solution
L-Hisitidine, 98%, 100 g Avantor/ VWR CA97062-598 universal neutralizing solution
MBEC Assay Inoculator with 96 well tray, 100/CS Innovotech 19112 material for 96 well MBEC device biofilm cultivation
McFarland Standard, 0.5 EA Fisher Scientific R20410 cell culture standardization
McFarland Standard, 1.0 EA Fisher Scientific R20411 cell culture standardization
NUNC 96-well microtiter plates, w/lid, 50/CS Fisher Scientific 167008 microplate for 96 well MBEC device biofilm cultivation and OD measurements
PCR plate, semi-skirted 96 well, fast PCR, polypropylene, 25ea/PK Sarstedt 72.1981.202 pegged lid for 96 well deepwell device biofilm cultivation
Petri dish, 100 mm x 15 mm, semi-TK CS/500 Fisher Scientific FB0875712 materials for LB agar preparation
Potassium phosphate dibasic, ACS 500 g Fisher Scientific P288-500 PBS component/ buffer
Sodium chloride, ACS grade, 3 kg Fisher Scientific S2713 media components for LB broth and PBS
sodium phosphate monobasic, 1 kg Fisher Scientific S369-1 PBS component/ buffer
Syringe filters, Sterile, PES 0.45 um, 25 mm, PK50 Avantor/ VWR 28145-505 non-autoclavable solution sterilization
Tin foil, heavy duty, 50 feet Grocery store — materials for deepwell device sterilization
Tryptone (peptone from casein), 2.2 kg/EA Fisher Scientific B11922 media components for LB broth
Tween-20, 100 mL Fisher Scientific BP337-100 recovery media solution
Ultra-deepwell, 2.5 mL deep well plates (square well), with lid, polypropylene, 10/CS Avantor/ VWR 37001-520 materials for biofilm dilution preparation
Yeast Extract, Fisher Bioreagents, 500 g Fisher Scientific BP1422-500 media components for LB broth
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Verderosa, A. D., Totsika, M., Fairfull-Smith, K. E. Bacterial Biofilm Eradication Agents: A Current Review. Frontiers in Chemistry. 7, 1-17 (2019).
  2. Sharma, D., Misba, L., Khan, A. U. Antibiotics versus biofilm: An emerging battleground in microbial communities. Antimicrobial Resistance and Infection Control. 8 (1), 1-10 (2019).
  3. Fux, C. A., Costerton, J. W., Stewart, P. S., Stoodley, P. Survival strategies of infectious biofilms. Trends in Microbiology. 13 (1), 34-40 (2005).
  4. Lagacé-Wiens, P. R. S., et al. Trends in antimicrobial resistance over 10 years among key bacterial pathogens from Canadian hospitals: results of the CANWARD study 2007-16. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74, 22-31 (2019).
  5. Karlowsky, J. A., et al. In vitro susceptibility of urinary Escherichia coli isolates to first- and second-line empirically prescribed oral antimicrobials: CANWARD surveillance study results for Canadian outpatients, 2007-2016. International Journal of Antimicrobial Agents. 54 (1), 62-68 (2019).
  6. Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiology. 7 (9), 1061-1072 (2012).
  7. Amato, S. M., et al. The role of metabolism in bacterial persistence. Frontiers in Microbiology. 5, 1-9 (2014).
  8. Flemming, H. -. C., Neu, T. R., Wozniak, D. J. The EPS matrix: The "house of biofilm cells.&#34. Journal of Bacteriology. 189 (22), 7945-7947 (2007).
  9. Dela Fuente-Núñez, C., Reffuveille, F., Fernández, L., Hancock, R. E. W. Bacterial biofilm development as a multicellular adaptation: Antibiotic resistance and new therapeutic strategies. Current Opinion in Microbiology. 16 (5), 580-589 (2013).
  10. Høiby, N., et al. The clinical impact of bacterial biofilms. International Journal of Oral Science. 3 (2), 55-65 (2011).
  11. Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O’Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Current Protocols in Microbiology. 01, (2005).
  12. Coffey, B. M., Anderson, G. G. Biofilm formation in the 96-well microtiter plate. Methods in Molecular Biology. 1149, 631-641 (2014).
  13. O’Toole, G. A. Microtiter dish Biofilm formation assay. Journal of Visualized Experiments. (47), e2437 (2010).
  14. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
  15. Harrison, J. J., Turner, R. J., Ceri, H. High-throughput metal susceptibility testing of microbial biofilms. BMC Microbiology. 5 (53), (2005).
  16. Ceri, H., et al. The MBEC Assay System: Multiple Equivalent Bioffims for Antibiotic and Biocide Susceptibility Testing. Methods in Enzymology. 337, 377-385 (2001).
  17. Harrison, J. J., et al. Microtiter susceptibility testing of microbes growing on peg lids: a miniaturized biofilm model for high-throughput screening. Nature Protocols. 5 (7), 1236-1254 (2010).
  18. vanden Driessche, F., Rigole, P., Brackman, G., Coenye, T. Optimization of resazurin-based viability staining for quantification of microbial biofilms. Journal of Microbiological Methods. 98, (2014).
  19. Sabaeifard, P., Abdi-Ali, A., Gamazo, C., Irache, J. M., Soudi, M. R. Improved effect of amikacin-loaded poly(D,L-lactide-co-glycolide) nanoparticles against planktonic and biofilm cells of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Medical Microbiology. 66 (2), 137-148 (2017).
  20. Thieme, L., et al. MBEC Versus MBIC: the Lack of Differentiation between Biofilm Reducing and Inhibitory Effects as a Current Problem in Biofilm Methodology. Biological Procedures Online. 21 (1), 18 (2019).
  21. Jennings, M. C., Ator, L. E., Paniak, T. J., Minbiole, K. P. C., Wuest, W. M. Biofilm-eradicating properties of quaternary ammonium amphiphiles: Simple mimics of antimicrobial peptides. Chembiochem. 15 (15), 2211-2215 (2014).
  22. Lineback, C. B., et al. Hydrogen peroxide and sodium hypochlorite disinfectants are more effective against Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms than quaternary ammonium compounds. Antimicrobial Resistance & Infection Control. 7 (1), 154 (2018).
  23. Minbiole, K. P. C., et al. From antimicrobial activity to mechanism of resistance: The multifaceted role of simple quaternary ammonium compounds in bacterial eradication. Tetrahedron. 72 (25), 3559-3566 (2016).
  24. Mangalappalli-Illathu, A. K., Korber, D. R. Adaptive resistance and differential protein expression of Salmonella enterica serovar enteritidis biofilms exposed to benzalkonium chloride. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3588-3596 (2006).
  25. El-Banna, T., Abd El-Aziz, A., Sonbol, F., El-Ekhnawy, E. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa clinical isolates to benzalkonium chloride retards its growth and enhances biofilm production. Molecular Biology Reports. 46, 3437-3443 (2019).
  26. Ebrahimi, A., et al. Effects of benzalkonium Chloride on planktonic growth and biofilm formation by animal bacterial pathogens. Jundishapur Journal of Microbiology. 8 (2), 59764 (2015).
  27. Reśliński, A., et al. Evaluation of Staphylococcus aureus and Escherichia coli biofilm formation on the surface of polypropylene mesh. Medycyna doświadczalna i mikrobiologia. 63 (1), 21-27 (2011).
  28. Verhorstert, K. W. J., et al. In vitro bacterial adhesion and biofilm formation on fully absorbable poly-4-hydroxybutyrate and nonabsorbable polypropylene pelvic floor implants. Cite This: ACS Applied Materials & Interfaces. 12, 53646-53653 (2020).
  29. Arkatkar, A., Juwarkar, A. A., Bhaduri, S., Uppara, P. V., Doble, M. Growth of Pseudomonas and Bacillus biofilms on pretreated polypropylene surface. International Biodeterioration & Biodegradation. 64 (6), (2010).
  30. Jones, J. F., et al. Oriented adhesion of Escherichia coli to polystyrene particles. Applied and Environmental Microbiology. 69 (11), 6515-6519 (2003).
  31. Zameer, F., et al. Evaluation of adhesive and anti-adhesive properties of Pseudomonas aeruginosa biofilms and their inhibition by herbal plants. Iranian Journal of Microbiology. 8 (2), 108-119 (2016).
  32. Arkatkar, A., Juwarkar, A. A., Bhaduri, S., Uppara, P. V., Doble, M. Growth of Pseudomonas and Bacillus biofilms on pretreated polypropylene surface. International Biodeterioration and Biodegradation. 64 (6), 530-536 (2010).
  33. Dieterich, M., et al. Implant-Based Breast Reconstruction Using a Titanium-Coated Polypropylene Mesh (TiLOOP Bra). Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (1), 8-19 (2013).
  34. Clavé, A., et al. Polypropylene as a reinforcement in pelvic surgery is not inert: comparative analysis of 100 explants. International Urogynecology Journal. 21 (3), 261-270 (2010).
  35. Zameer, F., et al. Evaluation of adhesive and anti-adhesive properties of Pseudomonas aeruginosa biofilms and their inhibition by herbal plants. Iranian Journal of Microbiology. 8 (2), 108-119 (2016).
  36. Chen, R., Liu, X., Han, L., Zhang, Z., Li, Y. Morphology, thermal behavior, rheological, and mechanical properties of polypropylene/polystyrene blends based on elongation flow. Polymers for Advanced Technologies. 31 (11), 2722-2732 (2020).
  37. Vial Loading Trays Polystyrene vs. polypropylene: Which tubes are best for your research. ChemTech International Available from: https://chemtech-us.com/polystyrene-vs-polypropylene-which-tubes-are-best-for-your-research/ (2020)
  38. Bock, L. J., Hind, C. K., Sutton, J. M., Wand, M. E. Growth media and assay plate material can impact on the effectiveness of cationic biocides and antibiotics against different bacterial species. Letters in Applied Microbiology. 66 (5), 368-377 (2018).
  39. . Crystal violet Available from: https://omic.org/spectra/PhotochemCAD/html/048.html (2017)

Tags

Bacterial BiofilmBiofilm BiomassPCR-plate Deep Well MicroplatePeg Lid Biofilm DeviceCrystal Violet StainingAntimicrobial Susceptibility TestingMinimum Biofilm Eradication Concentration (MBEC)

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Doucet, A. N., Slipski, C. J., Golding, G. R., Mulvey, M. R., Bay, D. C. Generation of Greater Bacterial Biofilm Biomass using PCR-Plate Deep Well Microplate Devices. J. Vis. Exp. (182), e63069, doi:10.3791/63069 (2022).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image