في الموقع تصور نمو المحور العصبي وديناميكيات مخروط النمو في مزارع شرائح الدماغ الجنينية الحادة خارج الجسم الحي
Summary
يوضح هذا البروتوكول طريقة مباشرة وقوية لدراسة نمو المحور العصبي في الموقع وديناميكيات مخروط النمو. وهو يصف كيفية إعداد شرائح الدماغ الحادة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية خارج الجسم الحي ويوفر خط أنابيب تحليل سهل الاستخدام.
Abstract
أثناء تطور الخلايا العصبية ، تتنقل المحاور العصبية في البيئة القشرية للوصول إلى وجهاتها النهائية وإنشاء اتصالات متشابكة. تقوم مخاريط النمو – الهياكل الحسية الموجودة في الأطراف البعيدة لتطوير المحاور العصبية – بتنفيذ هذه العملية. تعد دراسة بنية وديناميكيات مخروط النمو أمرا بالغ الأهمية لفهم التطور المحوري والتفاعلات مع الجهاز العصبي المركزي المحيط (CNS) التي تمكنه من تكوين دوائر عصبية. هذا أمر ضروري عند ابتكار طرق لإعادة دمج المحاور العصبية في الدوائر العصبية بعد الإصابة في البحوث الأساسية والسياقات قبل السريرية. حتى الآن ، يعتمد الفهم العام لديناميكيات مخروط النمو في المقام الأول على دراسات الخلايا العصبية المستزرعة في بعدين (2D). على الرغم من أنها أساسية بلا شك للمعرفة الحالية بالديناميكيات الهيكلية لمخروط النمو والاستجابة للمحفزات ، إلا أن دراسات 2D تحرف البيئة الفسيولوجية ثلاثية الأبعاد (3D) التي تواجهها مخاريط النمو العصبي في أنسجة الجهاز العصبي المركزي السليمة. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام المواد الهلامية الكولاجين للتغلب على بعض هذه القيود ، مما مكن من التحقيق في تطور الخلايا العصبية في 3D. ومع ذلك ، تفتقر كل من البيئات الاصطناعية 2D و 3D إلى إشارات الإشارة داخل أنسجة الجهاز العصبي المركزي ، والتي توجه الامتداد والبحث عن المسارات للمحاور الجذعية النامية. يوفر هذا البروتوكول طريقة لدراسة المحاور ومخاريط النمو باستخدام شرائح الدماغ العضوية ، حيث تواجه المحاور النامية إشارات فيزيائية وكيميائية ذات صلة فسيولوجيا. من خلال الجمع بين المضبوط بدقة في الرحم وخارج الرحم الكهربائي لتقديم مراسلات الفلورسنت بشكل ضئيل جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري فائق الدقة ، يقدم هذا البروتوكول خط أنابيب منهجي لتصور ديناميكيات مخروط المحور العصبي والنمو في الموقع. وعلاوة على ذلك، يتضمن وصفا مفصلا لمجموعة أدوات لتحليل بيانات التصوير الطويل الأجل وبيانات التصوير بالخلايا الحية.
Introduction
الخلايا العصبية هي خلايا شديدة الاستقطاب تمثل الوحدة الحسابية الأساسية في الجهاز العصبي. فهي تتلقى وتصدر معلومات تعتمد على تجزئة مواقع المدخلات والمخرجات: التشعبات والمحاور المحورية، على التوالي1. أثناء التطوير ، تمتد المحاور العصبية أثناء التنقل في بيئة معقدة لا تصدق للوصول إلى وجهتها. تسترشد الملاحة المحورية بمخروط النمو ، وهو هيكل حسي يقع عند طرف المحور المحوري النامي. مخروط النمو مسؤول عن اكتشاف الإشارات البيئية وترجمتها إلى إعادة التنظيم المكاني الديناميكي للهيكل الخلوي 2,3. تقوم التفاعلات المورفولوجية الميكانيكية الناتجة بتوجيه مخروط النمو إلى التمدد أو التراجع عن إشارة التحفيز ، مما يؤدي إلى مناورات محورية محددة.
ينبع الفهم الحالي لديناميكيات مخروط المحور العصبي والنمو من الدراسات التي تقيم نمو المحور العصبي على ركائز ثنائية الأبعاد (2D)2،4،5،6،7. حددت هذه الدراسات الرائدة التفاعل المتطور بين مخاريط النمو وركائز النمو وكشفت عن اختلافات مذهلة تعتمد على خصائص الركيزة مثل الالتصاق والصلابة 8,9. بقيادة هذه الرؤى ، تم افتراض الإشارات البيئية خارج الخلية لإملاء نمو المحور العصبي ، مع الهيكل الخلوي المخروطي للنمو الذي نفذ هذا النمو2،10،11،12. والجدير بالذكر أن الخلايا العصبية يمكنها تمديد المحاور العصبية في ركائز غير لاصقة (على سبيل المثال، بولي ليسين وبولي أورنيثين)13. علاوة على ذلك ، يمكن أن تؤثر صلابة الركيزة على معدل نمو المحور العصبي بشكل مستقل عن المجمعات اللاصقة للخلايا8. وبالتالي ، فإن دراسة ديناميكيات مخروط النمو في ركائز 2D وحدها لا يمكن أن تشكل بدقة توازن القوى التي تنشأ عن تفاعل مخاريط النمو المحورية مع البيئات ثلاثية الأبعاد (3D) ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ، مثل تلك الموجودة في الجسم الحي.
للتغلب على قيود الفحوصات ثنائية الأبعاد ، تمت دراسة نمو المحور العصبي وديناميكيات مخروط النمو في مصفوفات 3D 8,9. تشكل هذه المصفوفات سياقا فسيولوجيا أكثر ولكنها تسمح بدراسة الآليات الجوهرية الخلوية لنمو المحور العصبي. وهو يتيح فحص مخروط النمو بطريقة خلية واحدة في مجموعة متنوعة من الحالات والعلاجات الدوائية9. في مثل هذه البيئات ثلاثية الأبعاد ، أظهرت المحاور العصبية ديناميكيات هيكلية خلوية متميزة ونمت بشكل أسرع من تلك التي لوحظت في الخلايا العصبية المستزرعة 2D9. أظهرت هذه الدراسات الأنيقة تأثير بعد إضافي على إعادة تنظيم الهيكل الخلوي المخروطي للنمو ، وبالتالي على سلوكه.
على الرغم من المزايا الواضحة التي تقدمها مصفوفات 3D على الأسطح 2D في دعم التطور العصبي الشبيه بالسكان الأصليين ونمو المحور العصبي ، إلا أنها تظل سقالة اصطناعية مبسطة لا يمكنها أن تعكس تعقيد الديناميكيات التي لوحظت في أنسجة الجهاز العصبي المركزي (CNS). هنا ، تم الجمع بين تسليم البلازميدات المراسلة عن طريق الرحم الخارجي وفي الرحم الكهربائي مع ثقافة شرائح النمط العضوي في الدماغ والتصوير الحي فائق الدقة في الموقع لتحليل ديناميكيات مخروط النمو في سياق فسيولوجي. تسمح هذه المنهجية بتصور المحاور النامية أثناء تجربة 3-dimensionality في بيئات الجسم الحي وتعقيد تركيبتها الفيزيائية الكيميائية. وأخيرا، يتم وصف الإجراءات سهلة الاستخدام لقياس نمو المحور العصبي وديناميكيات مخروط النمو باستخدام برامج مرخصة بشكل شائع ومتاحة للجمهور.
Protocol
Representative Results
Discussion
كيف تستشعر مخاريط النمو وتتفاعل مع البيئة المحيطة بها لتنسيق تمديد وتوجيه المحور العصبي في وقت واحد لا تزال مسألة نقاش 3,18. قدمت الدراسات الرائدة في الركائز ثنائية الأبعاد لمحة عن الآليات الجزيئية الأساسية التي تولد القوى التي تدفع ديناميكيات مخروط النمو أثناء تكوين المحور العصبي والنمو والملاحة2،10،11،12،19. في الآونة الأخيرة ، كشفت الدراسات في مصفوفات 3D عن مدى تأثير البعد الثالث في سلوك مخروط النمو وبالتالي في نمو المحور العصبي 8,9. ومع ذلك، فإن الآليات المعقدة التي توجه ديناميات مخروط النمو في الجسم الحي لا تزال بحاجة إلى دراسة دقيقة.
يستخدم إعداد ثقافات شرائح النمط العضوي من أدمغة IUE أو EUE على نطاق واسع وموثق جيدا. لقد أصبح معيارا ذهبيا يسمح للعلماء باكتساب رؤى ثاقبة حول تطور وسلوك الخلايا العصبية في أنسجة المخ الحية20,21. في الواقع ، تم استخدام هذه التقنية بنجاح في تركيبة مع العديد من تقنيات التصوير عالية الدقة لتصور عمليات جزيئية محددة وأحداث مورفولوجية في الموقع. وتشمل هذه الدراسات ، على سبيل المثال لا الحصر تكوين المحور العصبي وامتداده 19،22 ، والهجرة العصبية القشرية 19،22،23،24 ، والديناميات المركزية 25،26 ، وديناميات الأنابيب الدقيقة27 ، وكذلك الديناميكيات الوظيفية للمقصورات قبل وبعد المشبكي28،29.
يعالج هذا البروتوكول فجوة في البيولوجيا العصبية التجريبية ، وتصور ديناميكيات مخروط النمو لتطوير الخلايا العصبية القشرية في الموقع ، في ثقافات شرائح الدماغ الحادة خارج الجسم الحي ، والأدوات اللازمة لتحليل البيانات التي تم الحصول عليها.
تم استخدام ثقافات شرائح الدماغ الحادة لإنشاء هذا البروتوكول لأنها (1) مع بعض الممارسة ، يسهل توليدها. (2) تقديم نظام يمكن الوصول إليه لدراسة مخاريط النمو المضمنة في بيئة شبه فسيولوجية كاملة ، ولكنها شفافة بما يكفي للسماح بتصوير الخلايا الحية عالي الدقة ؛ (3) يمكن توسيعها لاستخدامها مع عدد لا يحصى من خطوط الماوس المعدلة وراثيا ؛ (4) جنبا إلى جنب مع IUE أو EUE ، توفر إمكانات غير محدودة تقريبا لتقديم أدوات جزيئية لتقييم أداء مخاريط النمو والمحاور العصبية في الجسم الحي في ظل فقدان / كسب أنظمة الوظائف ، جنبا إلى جنب مع مراسلي الفلورسنت ومجسات الهيكل الخلوي.
وقد وصفت هذه المنهجية في سياق كل من الاتحاد الأوروبي والجامعة الإسلامية في أوروبا. على الرغم من أنها لا تزال طريقة موثوقة للغاية ، إلا أن EUE أدت إلى زيادة حدوث شرائح الدماغ التي تظهر شبكة RG غير منظمة مقارنة بتلك التي تم الحصول عليها باستخدام IUE كطريقة تسليم (الشكل 4C). تؤثر الاضطرابات في مصفوفة RG بشدة على هجرة الخلايا العصبية ونمط استطالة المحور العصبي30,31. هذه هي المعلمات الرئيسية التي تتنبأ بمكان العثور على محاور محورية للتحليل في وقت معين ونوع البيئة التي يتنقلون فيها. عادة ما تعاني شرائح الدماغ ذات شبكة RG المعطلة بشكل كبير من ضعف التقسيم الطبقي للخلايا العصبية القشرية . وهذا بدوره ينتج محاور ذات مسارات فوضوية. لذلك ، يوصى بشدة بالتحكم في السلامة الهيكلية لشبكة RG. ومن المثير للاهتمام أن ضعف السلامة الهيكلية يرتبط بزيادة عمر الدماغ الجنيني. في الواقع ، لم يتم ملاحظة مثل هذه الآثار في أجنة E12.5-E13.5 الأصغر سنا عادة19.
والبروتوكول الحالي شامل ومباشر. ومع ذلك ، هناك بعض الخطوات الحاسمة التي يجب فيها توخي الحذر والاهتمام الخاصين للحصول على أفضل النتائج. وقد أشير إلى ذلك صراحة في البروتوكول ويشمل (1) ضبط كمية الحمض النووي المستخدمة في المعالجة الكهربائية للحصول على علامات متفرقة؛ و (2) ضبط كمية الحمض النووي المستخدمة في المعالجة الكهربائية للحصول على علامات متفرقة؛ و (2) ضبط كمية الحمض النووي المستخدمة في المعالجة الكهربائية للحصول على علامات متفرقة؛ و (2) ضبط كمية الحمض النووي المستخدمة في المعالجة الكهربائية للحصول على علامات متفرقة؛ و (2) ضبط كمية الحمض النووي المستخدمة في المعالجة الكهربائية للحصول على علامات متفرق (2) تجنب الضرر أثناء استخراج الأدمغة ؛ (3) التحكم في درجة حرارة الأغاروز أثناء غلاف الدماغ ؛ (4) استكشاف الأخطاء وإصلاحها النسبة المئوية المثالية من الأغاروز لأدمغة عمر معين ؛ و (5) اختيار الفلوروفورات ، التي تتبع تجربتها. أثناء تحسين البروتوكول ، تم اختبار أداء العديد من الفلوروفورات في التصوير بالخلايا الحية في الموقع. تم اختيار متغيرات GFP الأحادية EGFP و NeonGreen لإعداد البلازميدات الموسومة LifeAct- و Lyn لهذا البروتوكول (الشكل 5A ، B). بالإضافة إلى ذلك ، تم اختبار متغير RFP mScarlet ووجد أنه مناسب للغاية لهذا الإعداد (البيانات غير معروضة). كما تم اختبار tRFP متعدد الوسائط (dimer) و ZsGreen (tetramer) (الشكل 5C والفيديو التكميلي 1 ، إلى اليمين). يوصى باستخدام هذه الفلوروفورات فائقة السطوع سريعة الطي عندما تتطلب الطريقة توليد إشارة فلورسنت سريعة بعد تسليم الحمض النووي.
من الممارسات الشائعة في استخدام مزارع الشرائح استخدام شرائح من أدمغة مختلفة لاختبار التحكم والظروف التجريبية. وهذا يمثل مصدرا متأصلا للتقلبات غير المرغوب فيها. هنا ، تم استخدام نظام تعبير يتيح تعديلا مستقلا للخلايا العصبية المجاورة وتعبير المراسلين لتحديد الهوية. لاحظ أنه في هذا العرض التوضيحي (الشكل 5C) ، لم تكن هناك اختلافات بين الخلايا العصبية التي تعبر عن أي من الفلوروفورات. ومع ذلك ، على سبيل المثال ، فإن مثل هذا المزيج من البلازميد جنبا إلى جنب مع خط الفأر المعدل وراثيا الذي يؤوي جينا حساسا ل Cre سوف يحمل الخلايا العصبية tRFP (الحساسة للدرد) التي بقيت كنوع بري. في المقابل ، فإن ZsGreen (أيضا Cre-sensitive) سوف يصنف الخلايا العصبية المعاد تجميعها. وبالتالي ، يمكن دراسة مخاريط النمو للنمطين الوراثيين المختلفين ، ومن المحتمل أيضا الأنماط الظاهرية ، جنبا إلى جنب في وقت واحد في نفس شريحة الدماغ.
يعد توطين المحاور ومخاريط النمو للتحليل أحد الاعتبارات المهمة. تستقطب الخلايا العصبية القشرية أثناء الهجرة شعاعيا من المنطقة البطينية (VZ) نحو الصفيحة القشرية (CP). خلال هذه العملية ، تشكل الخلايا العصبية عملية رائدة (تشعبات مستقبلية) وعملية زائدة ستصبح المحور العصبي ، وتنضم في النهاية إلى محاور رائدة في المنطقة الوسيطة (IZ) ، وإنشاء مسارات محورية32. لذلك ، لالتقاط مخاريط النمو المحوري ، تم إجراء التصوير على الألياف المحورية في IZ ، بما في ذلك المحاور العصبية الخارجة من CP والمحاور العصبية التي تم إنشاؤها مبكرا والمرتبطة بالفعل بالحزم المحورية ؛ أو في نهاية المطاف ، في الألياف التي تستعرض IZ وتمتد تحتها (الشكل 7).
يجعل هذا البروتوكول من الممكن إجراء تصوير فائق الدقة للخلايا العصبية داخل شرائح النمط العضوي. تاريخيا ، كان تشتت الضوء مشكلة كبيرة تواجه عند تصوير عينات سميكة. على مدى العقدين الماضيين ، جعلت التطورات الواسعة في التقنيات البصرية تصوير العينات السميكة ممكنا. هنا ، تم استخدام هدف مسافة العمل الطويلة لتصور الهياكل الأصغر بشكل أفضل ، مثل مخاريط النمو. لا مفر من أن هذا البروتوكول لا يلتقط أحداثا أكثر تفصيلا مثل تدفق الأكتين الرجعي أو ديناميكيات الأنابيب الدقيقة. يحافظ هدف مسافة العمل الطويلة، الذي يتطلب فتحة عدسة رقمية أقل (NA)، على المعلومات من الشرائح السميكة. ومع ذلك، كان من الممكن أيضا تكييف هذا البروتوكول لاستخدامه مع أهداف تقصير مسافة العمل. وهذا يتطلب نقلا سلسا للشرائح إلى طبق ذو قاع زجاجي للحفاظ على السلامة الهيكلية. ومع ذلك ، أدى استخدام هذه الطريقة إلى بقاء أقصر – ~ 15 ساعة – بسبب فقدان تبادل الغازات (البيانات غير معروضة). على عكس ثقافات 2D ، تحتل مخاريط النمو في 3D حجما أكبر وتتطلب تعويضا عن الحركة والقطع الأثرية في المحور z. لزيادة القدرة على تصوير الأحداث التفصيلية ، يجب استخدام التكنولوجيا البؤرية الحديثة. لذلك ، يوصى باستخدام محرك z-stack سريع المسح الضوئي ، مثل z-Galvo المتوفر على المجاهر البؤرية شديدة الحساسية33.
وتجدر الإشارة إلى أن هذا البروتوكول يقدم ثلاثة قيود رئيسية. أولا ، غالبا ما يكون من الصعب التحكم في مستويات التعبير / عدد الخلايا المعبرة عن أي بلازميد معين في الجسم الحي. هذا يدخل التباين بين جميع الشرائح حتى عند الحفاظ على نفس تركيز البلازميد. لذلك ، يجب تحديد اختيار العناصر التنظيمية في ناقلات التعبير المستخدمة مسبقا بعناية. ثانيا ، تصوير الأحداث التفصيلية باستخدام إدراج الغشاء غير ممكن حاليا. ويمكن التغلب على هذا القيد الثاني بالتحديثات المنهجية المقترحة في الفقرة السابقة. وأخيرا ، فإن مخاريط النمو حساسة للغاية للضوء ويمكن أن تصبح مبيضة ضوئيا بسرعة. لذلك ، فإن التصوير المتكرر لمخاريط النمو ، لمدة تقل عن 5 دقائق باستخدام المجاهر الماسحة بالليزر يمكن أن يؤدي في كثير من الأحيان إلى انهيار مخاريط النمو. في هذا الصدد ، يمكن تكييف التقدم الجديد في الأجهزة التي تم إنشاؤها بواسطة المجهر الضوئي للتصوير طويل الأجل لشرائح الدماغ34.
ومن المتوخى أن تفتح بروتوكولات من هذا القبيل طرقا بحثية جديدة، مما يسمح بفهم أفضل لما يتطلبه الأمر حتى يقرأ مخروط النمو ويتفاعل مع بيئة معقدة في الجسم الحي ، والأهم من ذلك، كشف آليات هذا التفاعل المتطور.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر ماريا يوجينيا بيرنيس على تصوير الإجراءات. كما نشكر إميلي بيرنسايد وإميلي هاندلي وثوربن بيترالا وماكس شيلسكي وسينا ستيرن على قراءة المخطوطة ومناقشتها. نحن ممتنون لمساعدينا الفنيين المتميزين ، جيسيكا جونير ، بلانكا راندل ، وآن توان فام. نحن نعترف بالدعم القيم لمرفق المجهر الضوئي ومرفق الحيوانات في DZNE. تم دعم هذا العمل من قبل Deutsche Forschungsgesellschaft (DFG) ، والمؤسسة الدولية للبحوث في الشلل النصفي (IRP) ، وأجنحة من أجل الحياة (إلى F.B). F.B. هو عضو في مجموعة التميز ImmunoSensation2 ، SFBs 1089 و 1158 ، وهو حاصل على جائزة Roger De Spoelberch.
Materials
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Goat Anti-Mouse |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Goat Anti-Mouse |
| Anti-Vimentin antibody | sigma-Aldrich | V2258-.2ML | Monoclonal mouse, clone LN-6, ascites fluid |
| B27 supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| Betadine | B. Braun | 3864154 | |
| Biozym Sieve GP Agarose | Biozyme | 850080 | |
| Braunol, Sprühflasche | B. Braun | 3864073 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | GEHE Pharma | 345928 | |
| DAPI | sigma-Aldrich | D9542 | |
| DMZ unevirsal electrode puller | Zeitz | NA | |
| Electric razor | Andes | NA | ProClip UltraEdge Super 2-Speed model |
| Enrofloxacin (Baytril) | Bayer | 3543238 | 2,5% (wt/vol) |
| Eppendorf microloader pipette tips | FischerScientific | 10289651 | |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | Dye content ≥ 85 % |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| Fiji 2.1.0 | NIH | NA | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | ToughCut/Straight/9cm |
| FluoroDish Cell Culture Dish | World Precision Instruments | FD5040-100 | |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
| Glucose | MedPex | 3705391 | 5% |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025092 | calcium, magnesium, no phenol red |
| Horse serum | Pan-Biotech | P30-0711 | |
| Imaris 9.7.2 | Bitplane | NA | https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists |
| Isoflurane | Virbac | NA | |
| Isotonic saline solution | B. Braun | 8609261 | 0.90% |
| Leica VT1200 S vibratome | Leica | 14048142066 | |
| LSM 880 with Airyscan | Zeiss | NA | |
| Metacam | Venusberg Apotheke | 8890217 | 5 mg/ml |
| Mice | Janvier Labs | NA | C57BL/6JRj |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E210 | 16.16.27 |
| Microsoft Excel | Microsoft | NA | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab |
| Millicell Cell Culture Insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm |
| Moria Perforated Spoons | Fine Science Tools | 10370-18 | |
| Moria Spoon | Fine Science Tools | 10321-08 | |
| Neurobasal Medium, minus phenol red | ThermoFisher Scientific | 12348017 | |
| Neuropan-2 supplement | Pan-Biotech | P07-11010 | |
| Normal goat serum | Abcam | ab138478 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder with Scissors | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| p-Tub-alpha-1-Dre | Addgene | 133925 | |
| p-Tub-alpha-1-iCre | Addgene | 133924 | |
| p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP | Addgene | 175437 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Paraformaldehyde | sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | |
| pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen | Addgene | 175438 | |
| pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen | Addgene | 175257 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PicoNozzle Kit v2 | World Precision Instruments | 5430-ALL | |
| Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus | 45-0487 | 1 mm / 3 mm |
| QIAGEN Maxi kit | QIAGEN | 12162 | |
| Reflex wound closure Clip | World Precision Instruments | 500344-10 | 7 mm |
| Sekundenkleber Pattex Mini Trio | Lyreco | 4722659 | |
| Square wave electroporation system ECM830 | Harvard Apparatus | W3 45-0052 | |
| Sterile gauze | Braun Askina | 9031216 | |
| Sterile lubricant eye ointment | Bayer Vital | PZN1578675 | |
| Sterile surgical gloves | Sempermed | 14C0451 | |
| Sucrose | Roth | 4621.2 | |
| Supramid 5-0 surgical silk sutures | B. Braun | NA | |
| Thin-wall glass capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| µ-Slide 8 Well Glass Bottom | Ibidi | 80827 |
Referencias
- Schelski, M., Bradke, F. Neuronal polarization: From spatiotemporal signaling to cytoskeletal dynamics. Molecular and Cellular Neurosciences. 84, 11-28 (2017).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).
- Stoeckli, E. T. Understanding axon guidance: are we nearly there yet. Development. 145 (10), (2018).
- Bradke, F., Dotti, C. G. The role of local actin instability in axon formation. Science. 283 (5409), 1931-1934 (1999).
- Neukirchen, D., Bradke, F. Cytoplasmic linker proteins regulate neuronal polarization through microtubule and growth cone dynamics. Journal of Neuroscience. 31 (4), 1528-1538 (2011).
- Witte, H., Bradke, F. The role of the cytoskeleton during neuronal polarization. Current Opinion in Neurobiology. 18 (5), 479-487 (2008).
- Witte, H., Neukirchen, D., Bradke, F. Microtubule stabilization specifies initial neuronal polarization. Journal of Cell Biology. 180 (3), 619-632 (2008).
- Nichol, R. H., Catlett, T. S., Onesto, M. M., Hollender, D., Gomez, T. M. Environmental elasticity regulates cell-type specific RHOA signaling and neuritogenesis of human neurons. Stem Cell Reports. 13 (6), 1006-1021 (2019).
- Santos, T. E., et al. Axon growth of CNS neurons in three dimensions is amoeboid and independent of adhesions. Cell Reports. 32 (3), 107907 (2020).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Cytoskeletal dynamics and nerve growth. Neuron. 1 (9), 761-772 (1988).
- Lin, C. H., Thompson, C. A., Forscher, P. Cytoskeletal reorganization underlying growth cone motility. Current Opinion in Neurobiology. 4 (5), 640-647 (1994).
- Myers, J. P., Gomez, T. M. Focal adhesion kinase promotes integrin adhesion dynamics necessary for chemotropic turning of nerve growth cones. Journal of Neuroscience. 31 (38), 13585-13595 (2011).
- Turney, S. G., et al. Nerve growth factor stimulates axon outgrowth through negative regulation of growth cone actomyosin restraint of microtubule advance. Molecular Biology of the Cell. 27 (3), 500-517 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Neuroscience. 7 (2), 136-144 (2004).
- Ferent, J., Zaidi, D., Francis, F. Extracellular control of radial glia proliferation and scaffolding during cortical development and pathology. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 578341 (2020).
- Dent, E. W., Gupton, S. L., Gertler, F. B. The growth cone cytoskeleton in axon outgrowth and guidance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), (2011).
- Dupraz, S., et al. RhoA controls axon extension independent of specification in the developing brain. Current Biology. 29 (22), 3874-3886 (2019).
- Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. In vitro, ex vivo and in vivo techniques to study neuronal migration in the developing cerebral cortex. Brain Sciences. 7 (5), (2017).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neurociencias. 305, 86-98 (2015).
- Namba, T., et al. Pioneering axons regulate neuronal polarization in the developing cerebral cortex. Neuron. 81 (4), 814-829 (2014).
- Shah, B., et al. Rap1 GTPases are master regulators of neural cell polarity in the developing neocortex. Cerebral Cortex. 27 (2), 1253-1269 (2017).
- Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse confocal imaging of migrating neurons in organotypic slice culture of embryonic mouse brain using in utero electroporation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), (2017).
- de Anda, F. C., Meletis, K., Ge, X., Rei, D., Tsai, L. H. Centrosome motility is essential for initial axon formation in the neocortex. Journal of Neuroscience. 30 (31), 10391-10406 (2010).
- Sakakibara, A., et al. Dynamics of centrosome translocation and microtubule organization in neocortical neurons during distinct modes of polarization. Cerebral Cortex. 24 (5), 1301-1310 (2014).
- Schatzle, P., Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Live imaging of microtubule dynamics in organotypic hippocampal slice cultures. Methods in Cell Biology. 131, 107-126 (2016).
- Qu, X., Kumar, A., Bartolini, F. Live imaging of microtubule dynamics at excitatory presynaptic boutons in primary hippocampal neurons and acute hippocampal slices. STAR Protocols. 2 (1), 100342 (2021).
- Tonnesen, J., Katona, G., Rozsa, B., Nagerl, U. V. Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses. Nature Neuroscience. 17 (5), 678-685 (2014).
- Buchsbaum, I. Y., Cappello, S. Neuronal migration in the CNS during development and disease: insights from in vivo and in vitro models. Development. 146 (1), (2019).
- Rigby, M. J., Gomez, T. M., Puglielli, L. Glial cell-axonal growth cone interactions in neurodevelopment and regeneration. Frontiers in Neuroscience. 14, 203 (2020).
- Barnes, A. P., Polleux, F. Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons. Annual Review of Neuroscience. 32, 347-381 (2009).
