Bruk av krystallfiolett for å forbedre visuell cytopatisk effektbasert lesing for viral titrering ved hjelp av TCID50-analyser

Viral titrering via TCID50-analyse er en vanlig brukt teknikk i forskning på smittsomme ^sykdommer1. Selv om variasjoner på matematikken bak denne metoden har blitt foreslått over ^tid1,2,3,4, er de for tiden anvendte metodene for infeksjonsdeteksjon avhengig av visuell bekreftelse gjennom tilstedeværelsen av cytopatisk effekt (CPE) ved hjelp av ^mikroskopi5. For å bekrefte CPE-visualisering mer objektivt på TCID50-analyser, er immunocytokjemisk (ICC) intracellulær farging rettet mot virusets proteiner en av de mest brukte ^metodene6, da forskjellige virus kan produsere forskjellige former for CPE. I vårt tilfelle er cellemorfologiske endringer like når de er smittet med både Influensa A-virus (IAV) og Porcine Reproduktivt og Respiratorisk syndrom Virus (PRRSV), hvor infiserte celler runder opp og løsner fra platen. Når det gjelder PRRSV, forårsaker det en CPE kjent som “total ødeleggelse”, hvor alle celler ender opp med å løsne fra brønnen. IAV derimot, kan presentere både total ødeleggelse og en ekstra CPE kjent som “subtotal ødeleggelse” der et lite antall celler ikke løsner etter ^infeksjon7. Denne teknikken er imidlertid tidkrevende å utføre og krever bruk av relativt kostbare reagenser. Det er viktig å merke seg at ICC ikke merker CPE, men heller antall celler som er infisert av viruset. Dette innebærer at cellene som ble vellykket smittet ved slutten av inkubasjonen, vil bli sett på som positive selv om infeksjonen ikke har forårsaket CPE ennå, og dermed forventes en høyere prosentandel av ICC-positive celler sammenlignet med CPE. Av den grunn beskriver vi i denne studien en komplementær metode for visuell deteksjon av CPE i en TCID50-analyse basert på krystallfiolett, et kjemikalie med en positiv ladning som festes til cellemembraner og brukes til å fargelegge celler. Krystallfiolett brukes ofte i virologiforskning for å måle plakkdannende enheter, blant ^andre8.

I denne studien sammenligner vi følsomheten til ikke-farget mikroskopi CPE-deteksjon med krystallfiolett farging og immunocytokjemisk farging basert på viral proteingjenkjenning, som er kjent for å være mer objektiv på grunn av sin høye følsomhet. Denne studien viser at både krystallfiolett og immunocytokjemisk farging er mer nøyaktig enn visuell mikroskopibasert CPE-deteksjon og kan brukes til objektivt å identifisere infiserte brønner i en TCID50-titrering. Gitt deres evne til å nå nesten identisk nøyaktighetsnivå på de cytopatiske virusene som er testet i cellelinjer, presenteres krystallfiolett som en raskere og rimeligere måte å bestemme virale titrasjoner på en TCID50-analyse. Den foreslåtte metoden ved hjelp av krystallfiolett farging tar en total tid på 40 min å utføre, med 15 min for paraformaldehyd (PFA) inkubasjon, 5 min for krystallfiolett inkubasjon og maksimalt 15 min for materialforberedelse, buffervask og tørking. Immunocytokjemiprotokollen som brukes til sammenligning tar en gjennomsnittlig tid på 4 t 30 min og ble utført som tidligere ^{beskrevet9,10}. Metoden som foreslås tar sikte på å visualisere en fullført viral titrering. Infeksjons- og inkubasjonstider kan utføres med forskjellig layout avhengig av viruset. Her testet vi to RNA-virus med cytopatisk effekt på cellelinjer.