क्रिस्टल वायलेट का उपयोग दृश्य Cytopathic प्रभाव में सुधार करने के लिए-TCID50 Assays का उपयोग कर वायरल अनुमापन के लिए पठन आधारित
Summary
यह प्रोटोकॉल क्रिस्टल वायलेट का उपयोग करके वायरल अनुमापन की कल्पना करने के लिए एक सटीक और उद्देश्य दृष्टिकोण दिखाता है, इसकी तुलना ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी और इम्यूनोसाइटोकेमिकल स्टेनिंग के साथ करके।
Abstract
वायरल अनुमापन विषाणु विज्ञान अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण परख है। TCID50 assays और पट्टिका बनाने वाली इकाइयों (PFU) assays के माध्यम से साइटोपैथिक प्रभाव (सीपीई) का पता लगाना वायरस स्टॉक के टिटर की गणना करने के लिए दो मुख्य तरीके हैं और अक्सर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए माइक्रोस्कोपी डिटेक्शन या सेल स्टेनिंग पर आधारित होते हैं। TCID50 परख के मामले में, उद्देश्य विज़ुअलाइज़ेशन आमतौर पर माइक्रोस्कोपी के माध्यम से दृश्य सीपीई का पता लगाने के साथ संयुक्त टिटर्स की गणना करने के लिए इंट्रासेल्युलर वायरस के immunocytochemical (आईसीसी) धुंधला पर आधारित है। हालांकि, आईसीसी धुंधला महंगा और समय लेने वाला है। इस अध्ययन में, हमने माइक्रोस्कोपी, आईसीसी स्टेनिंग और क्रिस्टल वायलेट स्टेनिंग के माध्यम से दृश्य सीपीई अवलोकन की तुलना की ताकि दो सीपीई-बनाने वाले वायरस, इन्फ्लूएंजा ए वायरस (आईएवी) के टिटर्स को निर्धारित किया जा सके सूअर मूल और पोर्सिनी प्रजनन और श्वसन सिंड्रोम वायरस (पीआरआरएसवी)। हम दिखाते हैं कि क्रिस्टल वायलेट और आईसीसी स्टेनिंग दोनों दृश्य सीपीई का पता लगाने की तुलना में अधिक सटीक हैं, जो आईएवी और पीआरआरएसवी दोनों पर परिशुद्धता के लगभग समान स्तर प्रस्तुत करते हैं। इस कारण से, यहां हम क्रिस्टल वायलेट स्टेनिंग को एक तेज़ और अधिक किफायती तरीके के रूप में पेश करते हैं ताकि सीपीई के लिए एक TCID50 परख पर वायरल अनुमापन निर्धारित किया जा सके- सेल लाइनों में titrated वायरस बनाने के लिए।
Introduction
TCID50 परख के माध्यम से वायरल अनुमापन संक्रामक रोग अनुसंधान 1 में एक आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक है। यद्यपि इस विधि के पीछे गणित पर विविधताओं को समय 1,2,3,4 के साथ प्रस्तावित किया गया है, संक्रमण का पता लगाने के वर्तमान में लागू तरीके माइक्रोस्कोपी 5 का उपयोग करके साइटोपैथिक प्रभाव (सीपीई) की उपस्थिति के माध्यम से दृश्य पुष्टि पर निर्भर करते हैं। TCID50 assays पर CPE विज़ुअलाइज़ेशन की अधिक निष्पक्ष रूप से पुष्टि करने के लिए, वायरस के प्रोटीन को लक्षित करने वाले immunocytochemical (ICC) इंट्रासेल्युलर स्टेनिंग सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले तरीकों में से एक है क्योंकि विभिन्न वायरस सीपीई के अलग-अलग रूपों का उत्पादन कर सकते हैं। हमारे मामले में, इन्फ्लूएंजा ए वायरस (आईएवी) और पोर्सिनी प्रजनन और श्वसन सिंड्रोम वायरस (पीआरआरएसवी) दोनों से संक्रमित होने पर सेल रूपात्मक परिवर्तन समान होते हैं, जहां संक्रमित कोशिकाएं प्लेट से गोल और अलग होती हैं। पीआरआरएसवी के मामले में, यह एक सीपीई का कारण बनता है जिसे “कुल विनाश” के रूप में जाना जाता है, जहां सभी कोशिकाएं कुएं से अलग हो जाती हैं। दूसरी ओर, आईएवी, कुल विनाश और एक अतिरिक्त सीपीई दोनों को पेश कर सकता है जिसे “उप-कुल विनाश” के रूप में जाना जाता है जहां कोशिकाओं की एक छोटी संख्या संक्रमण के बाद अलग नहीं होती है। हालांकि, यह तकनीक प्रदर्शन करने में समय लेने वाली है और अपेक्षाकृत महंगे अभिकर्मकों के उपयोग की आवश्यकता होती है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि आईसीसी सीपीई को लेबल नहीं करता है, बल्कि वायरस से सफलतापूर्वक संक्रमित कोशिकाओं की संख्या है। इसका तात्पर्य यह है कि इनक्यूबेशन के अंत तक सफलतापूर्वक संक्रमित होने वाली कोशिकाओं को सकारात्मक के रूप में देखा जाएगा, भले ही संक्रमण ने अभी तक सीपीई का कारण नहीं बनाया हो, और इस प्रकार, सीपीई की तुलना में आईसीसी सकारात्मक कोशिकाओं का एक उच्च प्रतिशत होने की उम्मीद है। इस कारण से, इस अध्ययन में हम क्रिस्टल वायलेट के आधार पर एक TCID50 परख में सीपीई के दृश्य का पता लगाने की एक पूरक विधि का वर्णन करते हैं, एक सकारात्मक चार्ज के साथ एक रसायन जो सेल झिल्ली से जुड़ता है और अनुयायी कोशिकाओं को दागने के लिए उपयोग किया जाता है। क्रिस्टल वायलेट का उपयोग अक्सर विषाणु विज्ञान अनुसंधान में पट्टिका बनाने वाली इकाइयों को मापने के लिए किया जाता है, दूसरों के बीच 8।
इस अध्ययन में, हम वायरल प्रोटीन मान्यता के आधार पर क्रिस्टल वायलेट स्टेनिंग और इम्यूनोसाइटोकेमिकल स्टेनिंग के साथ गैर-दाग माइक्रोस्कोपी सीपीई का पता लगाने की संवेदनशीलता की तुलना करते हैं, जो इसकी उच्च संवेदनशीलता के कारण अधिक उद्देश्य माना जाता है। इस अध्ययन से पता चलता है कि क्रिस्टल वायलेट और इम्यूनोसाइटोकेमिकल स्टेनिंग दोनों दृश्य माइक्रोस्कोपी-आधारित सीपीई डिटेक्शन की तुलना में अधिक सटीक हैं और इसका उपयोग टीसीआईडी 50 अनुमापन में संक्रमित कुओं की निष्पक्ष पहचान करने के लिए किया जा सकता है। सेल लाइनों में परीक्षण किए गए साइटोपैथिक वायरस पर सटीकता के लगभग समान स्तर तक पहुंचने की उनकी क्षमता को देखते हुए, क्रिस्टल वायलेट को एक TCID50 परख पर वायरल अनुमापन निर्धारित करने के लिए एक तेज़ और अधिक किफायती तरीके के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। क्रिस्टल वायलेट स्टेनिंग का उपयोग करने वाली प्रस्तावित विधि को प्रदर्शन करने में 40 मिनट का कुल समय लगता है, पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) इनक्यूबेशन के लिए 15 मिनट, क्रिस्टल वायलेट इनक्यूबेशन के लिए 5 मिनट और सामग्री तैयार करने, बफर धोने और सुखाने के लिए अधिकतम 15 मिनट। तुलना के लिए लागू इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल में 4 घंटे 30 मिनट का औसत समय लगता है और पहले वर्णित 9,10 के रूप में किया गया था। प्रस्तावित विधि का उद्देश्य एक पूर्ण वायरल अनुमापन की कल्पना करने में मदद करना है। संक्रमण और इनक्यूबेशन बार वायरस के आधार पर अलग-अलग लेआउट के साथ किया जा सकता है। यहां हमने सेल लाइनों पर साइटोपैथिक प्रभाव के साथ दो आरएनए वायरस का परीक्षण किया।
Protocol
Representative Results
Discussion
वायरल अनुमापन नियमित रूप से वायरोलॉजी अनुसंधान में उपयोग किया जाता है, जिसमें PFU का पता लगाने और TCID50 assays सबसे अधिक उपयोग किया जाता है1,2,3,4। दोनों विधियां संक?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक पांडुलिपि में अपनी सहायक टिप्पणियों के लिए डॉ फ्रैंक शोले को स्वीकार करना चाहते हैं, माइक्रोस्कोपी छवियों के साथ उनकी मदद के लिए क्लोई मैरिएंट और उनके सहायक अंग्रेजी संशोधन के लिए टेरेसा एम।
Materials
| 96-well cell culture plates | Genesee | 25-221 | Clear, flat bottom |
| AEC solution | Thermo Fisher | 1122 | |
| Crystal violet | Thermo Fisher | C581-25; C581-100 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1480 | |
| Paraformaldehide | Thermo Fisher | J19943 | |
| Primary Influenza Antibody | Bioss | BS-0344R | |
| Primary PRRSV Antibody | Bioss | BS-10043R | |
| Saponin | Thermo Scientific | AAA1882014 | |
| Secondaty antibody | Invitrogen | 31460 | |
| Tris Hydrochloride | Thermo Scientific | AM9856 |
Referencias
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