Monstervoorbereiding met behulp van een lipide monolaagmethode voor elektronenkristallografische studies
Summary
Lipide monolagen worden al tientallen jaren gebruikt als basis voor het vormen van tweedimensionale (2D) eiwitkristallen voor structurele studies. Ze zijn stabiel op het lucht-water interface en kunnen dienen als een dun ondersteunend materiaal voor elektronenbeeldvorming. Hier presenteren we de bewezen stappen voor het voorbereiden van lipide monolagen voor biologische studies.
Abstract
Elektronenkristallografie is een krachtig hulpmiddel voor het bepalen van structuren met hoge resolutie. Macromoleculen zoals oplosbare of membraaneiwitten kunnen onder gunstige omstandigheden worden gekweekt tot zeer geordende tweedimensionale (2D) kristallen. De kwaliteit van de gekweekte 2D kristallen is cruciaal voor de resolutie van de uiteindelijke reconstructie via 2D beeldverwerking. In de loop der jaren zijn lipide monolagen gebruikt als een ondersteunende laag om de 2D-kristallisatie van perifere membraaneiwitten en oplosbare eiwitten te bevorderen. Deze methode kan ook worden toegepast op 2D-kristallisatie van integrale membraaneiwitten, maar vereist uitgebreider empirisch onderzoek om detergent- en dialyseomstandigheden te bepalen om partitionering naar de monolaag te bevorderen. Een lipide monolaag vormt zich op het lucht-water interface zodanig dat de polaire lipidekopgroepen gehydrateerd blijven in de waterige fase en de niet-polaire, acylketens, staarten zich in de lucht afscheiden, waardoor de oppervlaktespanning wordt verbroken en het wateroppervlak wordt afgevlakt. De geladen aard of onderscheidende chemische eigenschappen van de kopgroepen bieden affiniteit voor eiwitten in oplossing, waardoor binding voor 2D-arrayvorming wordt bevorderd. Een nieuw gevormde monolaag met de 2D-array kan gemakkelijk worden overgedragen in een elektronenmicroscoop (EM) op een met koolstof gecoat koperen raster dat wordt gebruikt om de kristallijne array op te tillen en te ondersteunen. In dit werk beschrijven we een lipide monolaag methodologie voor cryogene elektronen microscopische (cryo-EM) beeldvorming.
Introduction
Elektronendiffractie door 2D-kristallen of spiraalvormige arrays van eiwitten kan sub-nanometerresoluties bereiken in gunstige gevallen1,2,3. Van bijzonder belang zijn gereconstitueerde 2D-membraaneiwitarrays of kristallen in hun near-native omgevingen1. Omdat een kristal fungeert als een signaalversterker die de intensiteit van de structurele factoren bij specifieke ruimtelijke frequenties verbetert, maakt elektronenkristallografie het mogelijk om een doelwit te onderzoeken met een kleinere grootte bij hoge resoluties, zoals kleine moleculen, dan die voor cryo-EM met één deeltje. De elektronenbundel kan worden gediffracteerd door een geordende 2D-array van eiwitten, waardoor een diffractiepatroon of een roosterbeeld wordt gegenereerd, afhankelijk van waar het beeldvlak wordt geregistreerd op de detector4. De diffracted intensiteiten kunnen vervolgens worden geëxtraheerd en verwerkt om een 2D-projectiestructuur van het kristal te reconstrueren. Elektronen hebben een grotere verstrooiingsdoorsnede dan röntgenstralen en de verstrooiing ervan volgt meestal het Rutherford-model op basis van de Coulomb-interactie tussen de elektronen en de geladen atomen in het molecuul5. De diktes van 2D-membraankristallen zijn meestal minder dan 100 nm, geschikt voor elektronenoverdracht zonder dynamische verstrooiing binnen monster6. Van elektronkristallografische studies is aangetoond dat het een krachtig hulpmiddel is om structurele informatie met hoge resolutie van membraaneiwitten en lipide-eiwitinteracties7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17te onderzoeken.
Een lipide monolaag is een enkele lipidelaag die bestaat uit fosfolipiden die dicht opeengepakt zijn op een lucht-waterinterface6, die de vorming van 2D-arrays voor oplosbare eiwitten of perifere membraaneiwitten kan helpen18. Afhankelijk van de dichtheid van de lipiden en hun laterale druk, kunnen de lipidemoleculen een geordende 2D-array vormen op de lucht-waterinterface met hun acylketens uitgebreid naar de lucht en hydrofiele hoofdgroepen blootgesteld in de waterige oplossing1,6,19. De lipidehoofdgroep kan interageren met eiwitten via elektrostatische interactie of kan worden aangepast om een affiniteitstag te bieden om een specifiek eiwitdomein te binden. Bijvoorbeeld, de DOGS-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl]2- Ni2+) wordt vaak gebruikt bij het vormen van een lipide monolaag om de eiwitten te binden met een poly-histidine tag20,21,22. Ook kan het choleratoxine B een bepaalde pentasaccharide van ganglioside GM1 binden in een lipide monolaag voor structurele studies23,24. Door de eiwitten op de lipidehoofdgroepen te verankeren, kan de lipide monolaag helpen bij de vorming van de 2D-arrays die dun zijn voor elektronenkristallografische studies met hoge resolutie. De lipide monolayer techniek is gebruikt in de elektronenkristallografie voor structurele studies van eiwitten, zoals streptavidin2,25,annexine V26,cholera toxine27, E. coli gyrase B subunit28, E. coli RNA polymerase 25,29,30, carboxysome shell proteins31 en de capsid eiwitten van het HIV-132 en Moloney murine leukemie virus 33. Vanwege de stabiliteit en chemische eigenschap van de lipide monolaag, zijn verschillende toepassingen voor monstervoorbereiding onderzocht voor cryo-EM-beeldvorming34. Optimalisatie zal echter nodig zijn voor de vorming van eiwitarrays.
Hier geven we uitgebreide details over de algemene voorbereiding van lipide monolagen voor cryo-EM beeldvorming en enkele overwegingen die de kwaliteit van de gevormde monolagen kunnen beïnvloeden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een lipide monolaag is een krachtig hulpmiddel dat de groei van grote 2D-kristallen vergemakkelijkt voor structurele studies van biologische macromoleculen. Om met succes een intacte lipide monolaag op het lucht-water interface te bereiden, wordt het sterk aanbevolen dat de lipiden vers worden bereid op de dag van het experiment, omdat oxidatie van de lipide acylketen kan leiden tot verstoring van de verpakking in de monolaag en de resulterende kristalvorming nadelig kan beïnvloeden. Gekochte lipiden in poedervorm moete…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De voorbereiding van dit manuscript werd gedeeltelijk ondersteund door het US Army Research Office (W911NF2010321) en de start-upfondsen van de Arizona State University aan P.-L.C.
Materials
| 14:0 PC (DMPC) | Avanti Lipids | 850345 | 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL |
| Bulb for small pipets | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Desiccator vacuum | Southern Labware | 55207 | |
| EM grids | Electron Microscopy Sciences | CF413-50 | CF-1.2/1.3-4C 1.2 µm hole, 1.3 µm space |
| Filter paper | GE Healthcare Life Sciences | 1001-090 | Diameter 90 mm |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Hamilton syringe (25 µL) | Hamilton Company | 80465 | |
| Hamilton syringe (250 µL) | Hamilton Company | 81165 | |
| Hamilton syringe (5 µL) | Hamilton Company | 87930 | |
| Hamilton syringe (500 µL) | Hamilton Company | 203080 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | M1775-1GA | |
| Petri dish | VWR | 25384-342 | 100 mm × 15 mm |
| Teflon block | Grainger | 55UK05 | 60 µL wells with side injection ports, manually made |
| Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 78325 | Various styles |
| Ultra-pure water | |||
| Ultrasonic cleaner | VWR | 97043-996 |
Referencias
- Raunser, S., Walz, T. Electron crystallography as a technique to study the structure on membrane proteins in a lipidic environment. Annual Review of Biophysics. 38 (1), 89-105 (2009).
- Avila-Sakar, A. J., Chiu, W. Visualization of beta-sheets and side-chain clusters in two-dimensional periodic arrays of streptavidin on phospholipid monolayers by electron crystallography. Biophysical Journal. 70 (1), 57-68 (1996).
- Braun, T., Engel, A. Two-dimensional electron crystallography. Nature Encyclopedia of Life Sciences. , (2004).
- Wang, H. -. W., Wang, J. -. W. How cryo-electron microscopy and X-ray crystallography complement each other. Protein Science: a publication of the Protein Society. 26 (1), 32-39 (2017).
- Williams, D. B., Carter, C. B. . Transmission electron microscopy. , (2016).
- Abeyrathne, P. D., et al. 1.15 Analysis of 2-D Crystals of Membrane Proteins by Electron Microscopy. Comprehensive Biophysics. , 277-310 (2012).
- Muller, M. P., et al. Characterization of Lipid-Protein Interactions and Lipid-Mediated Modulation of Membrane Protein Function through Molecular Simulation. Chemical Reviews. 119 (9), 6086-6161 (2019).
- Martínez-Ballesta, M. D. C., Carvajal, M. Mutual Interactions between Aquaporins and Membrane Components. Frontiers in Plant Science. 7, 1322 (2016).
- Hite, R. K., Chiu, P. -. L., Schuller, J. M., Walz, T. Effect of lipid head groups on double-layered two-dimensional crystals formed by aquaporin-0. PloS One. 10 (1), 0117371 (2015).
- Murata, K., et al. Structural determinants of water permeation through aquaporin-1. Nature. 407 (6804), 599-605 (2000).
- Schenk, A. D., et al. The 4.5 A structure of human AQP2. Journal of Molecular Biology. 350 (2), 278-289 (2005).
- Gonen, T., et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638 (2005).
- Hiroaki, Y., et al. Implications of the aquaporin-4 structure on array formation and cell adhesion. Journal of Molecular Biology. 355 (4), 628-639 (2006).
- Gonen, T., Sliz, P., Kistler, J., Cheng, Y., Walz, T. Aquaporin-0 membrane junctions reveal the structure of a closed water pore. Nature. 429 (6988), 193-197 (2004).
- Chiu, P. -. L., et al. The structure of the prokaryotic cyclic nucleotide-modulated potassium channel MloK1 at 16 A resolution. Structure. 15 (9), 1053-1064 (2007).
- Kowal, J., et al. Ligand-induced structural changes in the cyclic nucleotide-modulated potassium channel MloK1. Nature Communications. 5, 3106 (2014).
- Walz, T., Grigorieff, N. Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins. Journal of Structural Biology. 121 (2), 142-161 (1998).
- Yeager, M., Dryden, K. A., Ganser-Pornillos, B. K. Lipid monolayer and sparse matrix screening for growing two-dimensional crystals for electron crystallography: methods and examples. Methods in Molecular Biology. 955, 527-537 (2013).
- Pal, S. Chapter 6 – Structure analysis and visualization. Fundamentals of Molecular Structural Biology. , 119-147 (2020).
- Frey, W., et al. Two-dimensional protein crystallization via metal-ion coordination by naturally occurring surface histidines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4937-4941 (1996).
- Kubalek, E. W., Le Grice, S. F., Brown, P. O. Two-dimensional crystallization of histidine-tagged, HIV-1 reverse transcriptase promoted by a novel nickel-chelating lipid. Journal of Structural Biology. 113 (2), 117-123 (1994).
- Vénien-Bryan, C., et al. Structural study of the response regulator HupR from Rhodobacter capsulatus. Electron microscopy of two-dimensional crystals on a nickel-chelating lipid. Journal of Molecular Biology. 274 (5), 687-692 (1997).
- Merritt, E. A., Sarfaty, S., vanden Akker, F., L’Hoir, C., Martial, J. A., Hol, W. G. Crystal structure of cholera toxin B-pentamer bound to receptor GM1 pentasaccharide. Protein Science: a publication of the Protein Society. 3 (2), 166-175 (1994).
- Mosser, G., Mallouh, V., Brisson, A. A 9 A two-dimensional projected structure of cholera toxin B-subunit-GM1 complexes determined by electron crystallography. Journal of Molecular Biology. 226 (1), 23-28 (1992).
- Edwards, A. M., Darst, S. A., Hemming, S. A., Li, Y., Kornberg, R. D. Epitaxial growth of protein crystals on lipid layers. Nature Structural Biology. 1 (3), 195-197 (1994).
- Olofsson, A., Mallouh, V., Brisson, A. Two-dimensional structure of membrane-bound annexin V at 8 A resolution. Journal of Structural Biology. 113 (3), 199-205 (1994).
- Ribi, H. O., Ludwig, D. S., Mercer, K. L., Schoolnik, G. K., Kornberg, R. D. Three-dimensional structure of cholera toxin penetrating a lipid membrane. Science. 239 (4845), 1272-1276 (1988).
- Celia, H., et al. Three-dimensional model of Escherichia coli gyrase B subunit crystallized in two-dimensions on novobiocin-linked phospholipid films. Journal of Molecular Biology. 236 (2), 618-628 (1994).
- Darst, S. A., Kubalek, E. W., Kornberg, R. D. Three-dimensional structure of Escherichia coli RNA polymerase holoenzyme determined by electron crystallography. Nature. 340 (6236), 730-732 (1989).
- Schultz, P., et al. Structural study of the yeast RNA polymerase A. Electron microscopy of lipid-bound molecules and two-dimensional crystals. Journal of Molecular Biology. 216 (2), 353-362 (1990).
- Dryden, K. A., Crowley, C. S., Tanaka, S., Yeates, T. O., Yeager, M. Two-dimensional crystals of carboxysome shell proteins recapitulate the hexagonal packing of three-dimensional crystals. Protein Science: a publication of the Protein Society. 18 (12), 2629-2635 (2009).
- Barklis, E., McDermott, J., Wilkens, S., Fuller, S., Thompson, D. Organization of HIV-1 capsid proteins on a lipid monolayer. The Journal of BIOLOGICAL CHemistry. 273 (13), 7177-7180 (1998).
- Barklis, E., et al. Structural analysis of membrane-bound retrovirus capsid proteins. The EMBO Journal. 16 (6), 1199-1213 (1997).
- Kelly, D. F., Dukovski, D., Walz, T. Monolayer purification: a rapid method for isolating protein complexes for single-particle electron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4703-4708 (2008).
- Reis, A., Rudnitskaya, A., Blackburn, G. J., Mohd Fauzi, N., Pitt, A. R., Spickett, C. M. A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL. Journal of Lipid Research. 54 (7), 1812-1824 (2013).
- Ueda, E. K. M., Gout, P. W., Morganti, L. Current and prospective applications of metal ion-protein binding. Journal of Chromatography. A. 988 (1), 1-23 (2003).
- Dietrich, J., nien-Bryan, C. . Strategies for Two-dimensional Crystallization of Proteins Using Lipid Monolayers. , (2005).
- Kuang, Q., Purhonen, P., Hebert, H. Two-Dimensional Crystallization Procedure, from Protein Expression to Sample Preparation. BioMed Research International. 2015, 693869 (2015).
- De Zorzi, R., Nicholson, W. V., Guigner, J. -. M., Erne-Brand, F., Vénien-Bryan, C. Growth of large and highly ordered 2D crystals of a K+ channel, structural role of lipidic environment. Biophysical Journal. 105 (2), 398-408 (2013).
- Johnson, M. C., Schmidt-Krey, I. Two-dimensional crystallization by dialysis for structural studies of membrane proteins by the cryo-EM method electron crystallography. Methods in Cell Biology. 113, 325-337 (2013).
- Rémigy, H. -. W., Caujolle-Bert, D., Suda, K., Schenk, A., Chami, M., Engel, A. Membrane protein reconstitution and crystallization by controlled dilution. FEBS Letters. 555 (1), 160-169 (2003).
- Braun, T., Kaufmann, T. C., Rémigy, H., Engel, A. Two-dimensional Crystallization of Membrane Proteins. Encyclopedic Reference of Genomics and Proteomics in Molecular Medicine. , 1936-1942 (2006).
- Lebeau, L., Vénien-Bryan, C. Monolayer two-dimensional crystallization of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 955, 59-71 (2013).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Lebeau, L., et al. Two-dimensional crystallization of a membrane protein on a detergent-resistant lipid monolayer. Journal of Molecular Biology. 308 (4), 639-647 (2001).
