Probenvorbereitung für computertomographisch basierte dreidimensionale Visualisierung von Murinen Hintergliedmaßengefäßen
Summary
Hier beschreiben wir eine Visualisierungs- und Quantifizierungsmethode für murine Hintergliedmaßengefäße mittels Mikro-Röntgen-Computertomographie.
Abstract
Blutgefäße sind komplexe Netzwerke mit baumartigen Strukturen, und vaskuläre Netzwerke sind für die Aufrechterhaltung sowohl der Durchblutung als auch der Aufrechterhaltung der Organfunktion unerlässlich. Die Aufklärung des Mechanismus der Blutgefäßbildung ist daher äußerst nützlich, um Entwicklungsprozesse und pathologische Mechanismen aufzuklären. Murine Hintergliedmaßengefäße werden oft als Modell für physiologische und pathologische Angiogenese verwendet. Die Auswertung erfolgt hauptsächlich über eine zweidimensionale Methode unter Verwendung von Gewebeschnitten. Methoden zur Bewertung der dreidimensionalen (3D) Gefäßmorphologie sind jedoch besonders begrenzt. Dieser Beitrag stellt eine Methode zur Visualisierung der murinen Hintergliedmaßen mittels Computertomographie (CT) vor. Strahlungsundurchsichtiges Harz wird durch die absteigende Aorta injiziert und ganze Gefäße werden mit Farbstoff gefüllt. Durch die Einstellung des Zeitpunkts der Farbstoffinjektion ist auch eine arterielle Füllung möglich, und Proben können mit jedem Mikro-Röntgen-CT-Gerät gewonnen werden. Diese Kontrastmethode bietet eine grundlegende Technik für die 3D-Bewertung von murinen Blutgefäßen in den unteren Extremitäten. Darüber hinaus kann diese Methode verwendet werden, um alle Blutgefäße unterhalb des Zwerchfells zu visualisieren und Blutgefäße in den Bauchorganen zu bewerten.
Introduction
Blutgefäße sind komplexe Netzwerke mit baumartigen Strukturen. Angiogenese und neue Gefäßbildung spielen eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der Organhomöostase1. Die Angiogenese ist zur Behandlung von ischämischen und malignen Erkrankungen reguliert2. Es ist daher wichtig, die zugrunde liegenden Mechanismen der Angiogenese zu verstehen. Murine Hintergliedmaßengefäße werden oft als nützliches Modell für die Gefäßforschung verwendet3; Die ipsilaterale Ligatur der Arteria iliaca oder femoralis ist ein bekanntes Modell der Ischämie der hinteren Gliedmaßen, das zur Beurteilung der Angiogenese und des vaskulären Umbaus in der physiologischen und pathologischen Angiogenese4 verwendet wird. Die Beurteilung der Angiogenese erfolgt jedoch hauptsächlich durch Schnittfärbung, und die Methoden zur Bewertung der 3D-Gefäßmorphologie sind besonders begrenzt.
Im Vergleich zur Schnittfärbung ermöglicht CT eine 3D-Visualisierung. Kürzlich berichteten Weyers et al. über ein ausgeklügeltes Protokoll, das für die CT-Bildgebung geeignet ist und die Visualisierung des murinen koronaren Kreislaufsystems bei Erwachsenen ermöglicht5. Wir modifizierten ihre Methode, um eine Probenvorbereitungsmethode zu entwickeln, die für die CT-Bildgebung der Blutgefäße der unteren Extremität geeignet ist6. Hier wird ein strahlungsundurchsichtiges Harz durch die absteigende Aorta injiziert und Gefäße in den unteren Extremitäten mit Farbstoff gefüllt. Durch die Anpassung des Zeitpunkts der Farbstoffinjektion ist auch eine arterielle Füllung möglich, und Proben können mit jedem Mikro-Röntgen-Computertomographen gewonnen werden. Diese Kontrastmethode bietet eine grundlegende Technik für die 3D-Auswertung von murinen Blutgefäßen unterhalb des Zwerchfells und in Bauchorganen und den unteren Extremitäten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Bericht stellt eine ausgeklügelte Methode zur Visualisierung von Blutgefäßen im Unterkörper vor. Es gibt mehrere kritische Schritte in diesem Prozess: Der erste ist die Vorbereitung vor der Injektion von Kontrastmittel. Wenn nicht genügend Blut entfernt wird, füllt der Kontrast das System nicht aus. Zusätzlich stört die Einbeziehung von Luftblasen die Füllung des Kontrastes; daher muss die Luft im Kreislauf vollständig entfernt werden. Da das Kontrastmittel nicht unmittelbar nach der Injektion erstarrt, sollte die Probe nicht übermäßig bewegt werden.
Diese Methode ist nützlich, um die erhöhte Bildung von Blutgefäßen und Zirkulation, wie z.B. Kollateralzirkulation, zu bewerten. Umgekehrt ist es als Einschränkung schwierig, verengte Blutgefäße zu bewerten, da die Unterscheidung zwischen Stenose und einer künstlichen Reduktion des Kontrastmittels schwierig ist. Darüber hinaus ist es schwierig, Blutgefäße in Knochen zu bewerten, da die Trennung von Blut und Knochen schwierig ist.
Eine alternative Methode zur 3D-Visualisierung ist die Immunfärbung. Mit der Gewebereinigungstechnik stehen verschiedene Methoden für die 3D-Bildgebung zur Verfügung7. Die Immunfärbung ist vorteilhaft, da sie die Färbung spezifischer Proteine mit Antikörpern ermöglicht. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht stellt die Ganzkörperbildgebung auf der Grundlage von Immunostaining in Frage8; Die CT-basierte Bildgebung erfordert jedoch keine Vorbehandlung zur Gewebereinigung.
Diese Methode ermöglicht die Visualisierung aller Gefäße unterhalb des Zwerchfells, einschließlich der Bauchorgane. Die Angiogenese in den Bauchorganen hat einen starken Einfluss auf die Aufrechterhaltung der Homöostase und die Entwicklung von Krankheiten9,10. Da dieses Protokoll für die Beurteilung der Gefäße der unteren Extremitäten optimiert wurde, würde das organspezifische Priming die Visualisierung der Angiogenese ermöglichen, die mit jedem Faktor wie Entzündungen oder Tumoren assoziiert ist.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Yasuyo Kimura, Megumi Nagahiro und Saeko Tokunaga für die hervorragende technische Unterstützung im Tierversuch.
Materials
| 1 mL syringe | TERUMO | SS-01T | |
| 10% Formalin Solution | Fujifilm-Wako | 068-03841 | |
| 10x phosphate-buffered saline (-) (PBS) | Fujifilm-Wako | 163-25265 | Prepare 1x PBS |
| 22 G catheter (22 G S5 x 1" V(F)) | MEDIKIT | HP2140 | Only catheter is used. |
| 23 G needle | TERUMO | NN-2325R | Use as a pin |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Fujifilm-Wako | 163-20145 | |
| 5 mL syringe | |||
| 5-0 Suture with needle | Alfresa Pharma Corporation | ER1205SB45 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251-5G | For vasodilating solution |
| Dumont #55 Forceps | FST | No.11255-20 | |
| Extension tube | TOP | X2-FL50 | |
| Falcon 50 mL tube | CORNING | 352098 | |
| Graefe Forceps | FST | No.11051-10 | |
| Heparin Sodium 5,000 units/5 mL | Mochida Co. Ltd. | 224122458 | |
| Isoflurane | Fujifilm-Wako | 099-06571 | |
| Microfil Injection Compounds | Flow Tech Inc. | MV-117 | Mix liquid MV-Compound (stain) and MV-Diluent 1: 1 |
| Papaverine hydrochloride | Fujifilm | 164-18002 | For vasodilating solution |
| Small Animal Anesthetizer | Muromachi Kikai Co. Ltd. | MK-A100ecoW-ST | |
| Spring Scissors – Angled to Side | FST | No.15006-09 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | FST | No.14001-12 | |
| three-way cock | TERUMO | TS-TR1K | |
| Transfer pipette | SAMCO SCIENTIFIC | SM262-1S | Use for mixing contrast medium |
| X-ray CT scanner | Toshiba IT & Control Systems Corporation | TOSHIBA TOSCANNER 32300 FPD |
Referencias
- Folkman, J. Angiogenesis. Annual Review of Medicine. 57, 1-18 (2006).
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS One. 8 (12), 84047 (2013).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3740 (2012).
- Arima, Y., et al. Evaluation of collateral source characteristics with 3-dimensional analysis using micro-X-ray computed tomography. Journal of the American Heart Association. 7 (6), 007800 (2018).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Fernandez, M., et al. Angiogenesis in liver disease. Journal of Hepatology. 50 (3), 604-620 (2009).
- Li, S., et al. Angiogenesis in pancreatic cancer: current research status and clinical implications. Angiogenesis. 22 (1), 15-36 (2019).
