Monstervoorbereiding voor op computertomografie gebaseerde driedimensionale visualisatie van murine achterpootvaten

Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor dierverzorging van de Kumamoto University (goedkeuringsreferentienummer. M30-040/A2020-105), die voldoen aan de Us National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (publicatie nr. 85-23, herzien 2011). 1. Voorbereiding Bereid het perfusieapparaat en de vaatverwijdende buffer voor (4 mg/l papaverinehydrochloride, 4 g/l; adenosine, 1 g/l; heparine, 1 E/ml in fosfaatgebuufferde zoutoplossing (PBS)).OPMERKING: Het refluxapparaat en de vaatverwijdende reagentia zijn dezelfde als die gerapporteerd door Weyers et al.5. Sluit de 22 G-katheter, de verlengbuis van 2 ml en de driewegstopkraan aan (figuur 1A).OPMERKING: Pas de meter aan op basis van de grootte van het dier. Voor volwassen C57BL/6 muizen is 22 G optimaal. Vul het drukperfusieapparaat met de vaatverwijdende buffer (figuur 1A).OPMERKING: Vermijd de vorming van bubbels om verstoring van de vulling van het contrastmedium te voorkomen. 2. Perfusie Injecteer 1 U/g heparine in PBS in de intraperitoneale holte 30 minuten voor de operatie. Verdoof de muis volledig met isofluraan en euthanaseer het door cervicale dislocatie. Maak na onthoofding een middellijnincisie in het borstbeen en bevestig de open thorax met pinnen.OPMERKING: Om lekkage van het contrast te voorkomen, moet u voorkomen dat het diafragma gewond raakt. Snijd de opgaande aorta en verwijder het hart. Verwijder de long en stel de dalende aorta bloot.OPMERKING: Verwond de dalende aorta niet. Snijd de dalende aorta diagonaal om de doorsnede bloot te leggen (figuur 1B).OPMERKING: Pel de aorta niet af; een diagonaal gedeelte is beter voor het inbrengen van katheters. Plaats de 22 G-katheter in de dalende aorta terwijl u de vaatverwijdingsbuffer gebruikt.OPMERKING: Het inbrengen van de katheter tijdens het uitvoeren van de vaatverwijdingsbuffer voorkomt luchtverontreiniging. Pin de wortel van de katheter (figuur 1C). Maak een knoop om lekkage door terugstroming te voorkomen. Perfuseer een verwarmde vaatverwijdende oplossing (papaverinehydrochloride, 4 g/L; adenosine, 1 g/L; heparine, 1 U/ml) gedurende 3 minuten bij een vaste druk tussen 13 en 15 kPa. Perfuseer een oplossing van 4% paraformaldehyde in (PBS) gedurende 3 min.OPMERKING: Het succes van fixatie kan worden bevestigd door de beweging van de voet (figuur 1D). Bereid het contrastmiddel vlak voor de perfusie.OPMERKING: Pas de verdunningssnelheid aan volgens het monster; voor volwassen muizen, meng de vlek en het verdunningsmiddel in een verhouding van 1: 1. Stop de perfusie en vul de verlengbuis met 2 ml verdund contrastmedium (figuur 1E).OPMERKING: Het contrastmiddel moet langzaam worden geïnjecteerd om letsel aan de bloedvaten te voorkomen. Perfundeer het contrastmedium bij een vaste druk tussen 13 en 15 kPa. Om de slagaders te visualiseren, controleert u de teennagel om te bevestigen dat het contrastmiddel de slagader heeft bereikt (figuur 1F). Om alle vaten te visualiseren, controleert u de inferieure vena cava van het diafragma om de volledige circulatie van het contrastmiddel te bevestigen.OPMERKING: In het begin bevat het contrast de vaatverwijdende oplossing; daarom is de juiste circulatie essentieel. Sluit de driewegstopkraan en verwijder de buis (figuur 1G).OPMERKING: Als de driewegstopkraan niet gesloten is, zal het contrast naar achteren stromen. Incubeer het monster een nacht bij 4 °C. Verwijder de huid en bevestig deze in 10% formaldehyde-oplossing. 3. Visualisatie OPMERKING: Visualisatieprotocollen verschillen afhankelijk van de CT-scanner. In dit protocol werd gebruik gemaakt van een microfocus X-ray CT scanner. Het is noodzakelijk om de beeldvormingsmethode te optimaliseren volgens elke CT-scanner. Bevestig het monster in een buis van 50 ml die PBS bevat. Leg de monsterbuis op tafel. Scan het monster met een spanning van 50 kV en een stroom van 600 μA en zorg voor een focus-tot-center afstand van 75,2 mm.OPMERKING: Een afmeting van 1 voxel was 28,7 μm x 28,7 μm x 28,7 μm in deze instelling. Laad de verkregen beeldgegevens met Fiji, een open-source platform voor biologische beeldanalyse. Bepaal de spier voxel waarde met behulp van de gastrocnemius spier. Kies de gastrocnemius spier met behulp van de rechthoek gereedschap. Controleer het gemiddelde en de standaarddeviatie (SD) van het histogram (| analyseren Histogram). Definieer de spier voxel dichtheid als gemiddelde + 2SD van de gastrocnemius spier. Stel de spiervoxeldichtheid in als het onderste drempelniveau (Afbeelding | pas | Drempel | | instellen lager drempelniveau).OPMERKING: Het vasculaire gebied en het botgebied blijven in de binarized gegevens nadat de drempel is ingesteld.