Preparación de muestras para la visualización tridimensional basada en tomografía computarizada de vasos murinos de las extremidades posteriores
Summary
Aquí, describimos un método de visualización y cuantificación para los vasos murinos de las extremidades posteriores utilizando tomografía computarizada de micro-rayos X.
Abstract
Los vasos sanguíneos son redes complejas con estructuras similares a árboles, y las redes vasculares son esenciales para mantener tanto la circulación como la función de los órganos. Por lo tanto, aclarar el mecanismo de formación de vasos sanguíneos es extremadamente útil para dilucidar los procesos de desarrollo y los mecanismos patológicos. Los vasos murinos de las extremidades posteriores se utilizan a menudo como modelo para la angiogénesis fisiológica y patológica. La evaluación se realiza principalmente a través de un método bidimensional utilizando secciones de tejido. Sin embargo, los métodos para evaluar la morfología vascular tridimensional (3D) son particularmente limitados. Este artículo presenta un método para visualizar las extremidades posteriores murinas mediante tomografía computarizada (TC). La resina opaca a la radiación se inyecta a través de la aorta descendente, y los vasos enteros se llenan con tinte. Al ajustar el tiempo de inyección de tinte, también es posible el llenado específico de la arteria, y se pueden obtener muestras con cualquier dispositivo de TC de micro-rayos X. Este método de contraste proporciona una técnica básica para la evaluación 3D de los vasos sanguíneos murinos en las extremidades inferiores. Además, este método se puede utilizar para visualizar todos los vasos sanguíneos debajo del diafragma y evaluar los vasos sanguíneos en los órganos abdominales.
Introduction
Los vasos sanguíneos son redes complejas con estructuras similares a árboles. La angiogénesis y la nueva formación vascular juegan un papel esencial en el mantenimiento de la homeostasis de los órganos1. La angiogénesis está regulada para el tratamiento de enfermedades isquémicas y malignas2. Por lo tanto, es esencial comprender los mecanismos subyacentes de la angiogénesis. Los vasos murinos de las extremidades posteriores se utilizan a menudo como un modelo útil para la investigación vascular3; La ligadura ipsilateral de la arteria ilíaca o femoral es un modelo conocido de isquemia de las extremidades posteriores utilizado para evaluar la angiogénesis y la remodelación vascular en la angiogénesis fisiológica y patológica4. Sin embargo, la evaluación de la angiogénesis se realiza principalmente mediante tinción de sección, y los métodos para evaluar la morfología vascular 3D son particularmente limitados.
En comparación con la tinción de sección, la TC permite la visualización 3D. Recientemente, Weyers et al. reportaron un sofisticado protocolo adecuado para la tomografía computarizada, permitiendo la visualización del sistema circulatorio coronario adulto murino5. Modificamos su método para crear un método de preparación de muestras adecuado para la obtención de imágenes por TC de los vasos sanguíneos de las extremidades inferiores6. Aquí, se inyecta una resina opaca a la radiación a través de la aorta descendente, y los vasos en las extremidades inferiores se llenan de tinte. Al ajustar el tiempo de inyección de tinte, también es posible el llenado específico de la arteria, y se pueden obtener muestras con cualquier dispositivo de tomografía computarizada de micro-rayos X. Este método de contraste proporciona una técnica básica para la evaluación 3D de los vasos sanguíneos murinos debajo del diafragma y en los órganos abdominales y las extremidades inferiores.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este informe presenta un método sofisticado para visualizar los vasos sanguíneos en la parte inferior del cuerpo. Hay varios pasos críticos en este proceso: el primero es la preperfusión antes de la inyección del medio de contraste. Si no se extrae suficiente sangre, el contraste no llenará el sistema. Además, la inclusión de burbujas de aire perturba el llenado del contraste; por lo tanto, el aire en el circuito debe eliminarse por completo. Además, debido a que el medio de contraste no se solidifica inmediatamente después de la inyección, la muestra no debe moverse excesivamente.
Este método es útil para evaluar el aumento de la formación de vasos sanguíneos y la circulación, como la circulación colateral. Por el contrario, como limitación, es difícil evaluar los vasos sanguíneos estrechados, ya que es difícil distinguir entre estenosis y una reducción artificial en el medio de contraste. Además, es difícil evaluar los vasos sanguíneos en los huesos, ya que la separación de la sangre y el hueso es difícil.
Un método alternativo para la visualización 3D es la inmunotinción. Utilizando la técnica de limpieza de tejidos, hay varios métodos disponibles para imágenes 3D7. La inmunotinción es ventajosa ya que permite la tinción de proteínas específicas utilizando anticuerpos. Un informe reciente desafía las imágenes de todo el cuerpo basadas en la inmunotinción8; sin embargo, las imágenes basadas en TC no requieren ningún tratamiento previo de limpieza de tejidos.
Este método permite la visualización de todos los vasos debajo del diafragma, incluidos los órganos abdominales. La angiogénesis en los órganos abdominales tiene un fuerte impacto en el mantenimiento de la homeostasis y el desarrollo de enfermedades9,10. Como este protocolo se optimizó para la evaluación de los vasos de las extremidades inferiores, el cebado específico de órganos permitiría la visualización de la angiogénesis asociada con cualquier factor, como inflamación o tumores.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Yasuyo Kimura, Megumi Nagahiro y Saeko Tokunaga por el excelente apoyo técnico en experimentos con animales.
Materials
| 1 mL syringe | TERUMO | SS-01T | |
| 10% Formalin Solution | Fujifilm-Wako | 068-03841 | |
| 10x phosphate-buffered saline (-) (PBS) | Fujifilm-Wako | 163-25265 | Prepare 1x PBS |
| 22 G catheter (22 G S5 x 1" V(F)) | MEDIKIT | HP2140 | Only catheter is used. |
| 23 G needle | TERUMO | NN-2325R | Use as a pin |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Fujifilm-Wako | 163-20145 | |
| 5 mL syringe | |||
| 5-0 Suture with needle | Alfresa Pharma Corporation | ER1205SB45 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251-5G | For vasodilating solution |
| Dumont #55 Forceps | FST | No.11255-20 | |
| Extension tube | TOP | X2-FL50 | |
| Falcon 50 mL tube | CORNING | 352098 | |
| Graefe Forceps | FST | No.11051-10 | |
| Heparin Sodium 5,000 units/5 mL | Mochida Co. Ltd. | 224122458 | |
| Isoflurane | Fujifilm-Wako | 099-06571 | |
| Microfil Injection Compounds | Flow Tech Inc. | MV-117 | Mix liquid MV-Compound (stain) and MV-Diluent 1: 1 |
| Papaverine hydrochloride | Fujifilm | 164-18002 | For vasodilating solution |
| Small Animal Anesthetizer | Muromachi Kikai Co. Ltd. | MK-A100ecoW-ST | |
| Spring Scissors – Angled to Side | FST | No.15006-09 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | FST | No.14001-12 | |
| three-way cock | TERUMO | TS-TR1K | |
| Transfer pipette | SAMCO SCIENTIFIC | SM262-1S | Use for mixing contrast medium |
| X-ray CT scanner | Toshiba IT & Control Systems Corporation | TOSHIBA TOSCANNER 32300 FPD |
Referencias
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- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
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- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3740 (2012).
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