Preparação amostral para visualização tridimensional baseada em tomografia computadorizada de vasos de membros traseiros murinos
Summary
Aqui, descrevemos um método de visualização e quantificação para vasos de membros traseiros murinos usando tomografia computadorizada de micro-raios-X.
Abstract
Os vasos sanguíneos são redes complexas com estruturas semelhantes a árvores, e redes vasculares são essenciais para manter a circulação e a manutenção da função dos órgãos. Esclarecer o mecanismo de formação de vasos sanguíneos é, portanto, extremamente útil para elucidar processos de desenvolvimento e mecanismos patológicos. Os vasos de membros traseiros de Murine são frequentemente usados como modelo para angiogênese fisiológica e patológica. A avaliação é realizada principalmente por meio de um método bidimensional utilizando seções teciduais. No entanto, os métodos de avaliação da morfologia vascular tridimensional (3D) são particularmente limitados. Este artigo introduz um método para visualizar membros traseiros murinos usando tomografia computadorizada (TC). A resina radioativa-opaca é injetada através da aorta descendente, e vasos inteiros são preenchidos com corante. Ao ajustar o tempo da injeção de corante, o preenchimento específico da arterial também é possível, e as amostras podem ser obtidas com qualquer dispositivo ct de raios-X. Este método de contraste fornece uma técnica básica para a avaliação 3D dos vasos sanguíneos murinos nas extremidades inferiores. Além disso, este método pode ser usado para visualizar todos os vasos sanguíneos abaixo do diafragma e avaliar os vasos sanguíneos nos órgãos abdominais.
Introduction
Vasos sanguíneos são redes complexas com estruturas semelhantes a árvores. A angiogênese e a nova formação vascular desempenham papéis essenciais na manutenção da homeostase do órgão1. A angiogênese é regulada para o tratamento de doenças isquêmicas e malignas2. Por isso, é essencial compreender os mecanismos subjacentes da angiogênese. Os vasos de membros traseiros murinos são frequentemente usados como um modelo útil para pesquisas vasculares3; ligação ipsilateral da artéria ilíaca ou femoral é um modelo conhecido de isquemia de membros traseiros usado para avaliar angiogênese e remodelagem vascular em angiogênese fisiológica e patológica4. No entanto, a avaliação da angiogênese é realizada principalmente por coloração de seção, e os métodos para avaliar a morfologia vascular 3D são particularmente limitados.
Em comparação com a coloração da seção, a tomografia permite a visualização 3D. Recentemente, Weyers et al. relataram um protocolo sofisticado adequado para imagens de tomografia computadorizada, permitindo a visualização do sistema circulatório coronário adulto murina5. Modificamos seu método para criar um método de preparação de amostras adequado para imagens de tomografia dos vasos sanguíneos da extremidade inferior6. Aqui, uma resina radio-opaca é injetada através da aorta descendente, e os vasos nas extremidades inferiores são preenchidos com corante. Ao ajustar o tempo da injeção de corante, o preenchimento específico da arterial também é possível, e as amostras podem ser obtidas com qualquer dispositivo de tomografia computadorizada de micro-raios-X. Este método de contraste fornece uma técnica básica para a avaliação 3D dos vasos sanguíneos murinos abaixo do diafragma e nos órgãos abdominais e nas extremidades inferiores.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este relatório introduz um método sofisticado para visualizar vasos sanguíneos na parte inferior do corpo. Existem várias etapas críticas nesse processo: a primeira é a pré-perfusão antes da injeção do meio de contraste. Se o sangue suficiente não for removido, o contraste não encherá o sistema. Além disso, a inclusão de bolhas de ar perturba o enchimento do contraste; assim, o ar no circuito deve ser completamente removido. Além disso, como o meio de contraste não se solidifica imediatamente após a injeção, a amostra não deve ser excessivamente movida.
Este método é útil para avaliar o aumento da formação de vasos sanguíneos e circulação, como a circulação colateral. Por outro lado, como limitação, é difícil avaliar os vasos sanguíneos estreitos, pois é difícil distinguir entre estenose e uma redução artificial no meio de contraste. Além disso, é desafiador avaliar os vasos sanguíneos nos ossos, pois a separação de sangue e osso é difícil.
Um método alternativo para visualização 3D é a imunostaining. Utilizando a técnica de limpeza tecidual, vários métodos estão disponíveis para imagens 3D7. A imunossuagem é vantajosa, pois permite a coloração de proteínas específicas usando anticorpos. Um relatório recente desafia imagens de corpo inteiro baseadas em imunostaining8; no entanto, a imagem baseada em TC não requer qualquer pré-tratamento de limpeza tecidual.
Este método permite a visualização de todos os vasos abaixo do diafragma, incluindo os órgãos abdominais. A angiogênese nos órgãos abdominais tem forte impacto na manutenção da homeostase e no desenvolvimento de doenças9,10. Como este protocolo foi otimizado para a avaliação dos vasos da extremidade inferior, a escoração específica dos órgãos permitiria a visualização de angiogênese associada a qualquer fator, como inflamação ou tumores.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Yasuyo Kimura, Megumi Nagahiro e Saeko Tokunaga pelo excelente suporte técnico em experimentos com animais.
Materials
| 1 mL syringe | TERUMO | SS-01T | |
| 10% Formalin Solution | Fujifilm-Wako | 068-03841 | |
| 10x phosphate-buffered saline (-) (PBS) | Fujifilm-Wako | 163-25265 | Prepare 1x PBS |
| 22 G catheter (22 G S5 x 1" V(F)) | MEDIKIT | HP2140 | Only catheter is used. |
| 23 G needle | TERUMO | NN-2325R | Use as a pin |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Fujifilm-Wako | 163-20145 | |
| 5 mL syringe | |||
| 5-0 Suture with needle | Alfresa Pharma Corporation | ER1205SB45 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251-5G | For vasodilating solution |
| Dumont #55 Forceps | FST | No.11255-20 | |
| Extension tube | TOP | X2-FL50 | |
| Falcon 50 mL tube | CORNING | 352098 | |
| Graefe Forceps | FST | No.11051-10 | |
| Heparin Sodium 5,000 units/5 mL | Mochida Co. Ltd. | 224122458 | |
| Isoflurane | Fujifilm-Wako | 099-06571 | |
| Microfil Injection Compounds | Flow Tech Inc. | MV-117 | Mix liquid MV-Compound (stain) and MV-Diluent 1: 1 |
| Papaverine hydrochloride | Fujifilm | 164-18002 | For vasodilating solution |
| Small Animal Anesthetizer | Muromachi Kikai Co. Ltd. | MK-A100ecoW-ST | |
| Spring Scissors – Angled to Side | FST | No.15006-09 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | FST | No.14001-12 | |
| three-way cock | TERUMO | TS-TR1K | |
| Transfer pipette | SAMCO SCIENTIFIC | SM262-1S | Use for mixing contrast medium |
| X-ray CT scanner | Toshiba IT & Control Systems Corporation | TOSHIBA TOSCANNER 32300 FPD |
Referencias
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- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS One. 8 (12), 84047 (2013).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3740 (2012).
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