Préparation d’échantillons pour la visualisation tridimensionnelle basée sur la tomodensitométrie des vaisseaux murins des membres postérieurs

Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux directives de soins aux animaux de l’Université de Kumamoto (référence d’approbation no. M30-040/A2020-105), qui sont conformes au Guide des états-Unis des National Institutes of Health pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire (publication n° 85-23, révisée en 2011). 1. Préparation Préparer l’appareil de perfusion et le tampon vasodilatateur (4 mg/L de chlorhydrate de papavérine, 4 g/L; adénosine, 1 g/L; héparine, 1 U/mL dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)).REMARQUE: Le dispositif de reflux et les réactifs vasodilatateurs sont les mêmes que ceux rapportés par Weyers et al.5. Connectez le cathéter de 22 G, le tube d’extension de 2 mL et le robinet d’arrêt à trois voies (Figure 1A).REMARQUE: Ajustez la jauge en fonction de la taille de l’animal. Pour les souris adultes C57BL/6, 22 G est optimal. Remplissez l’appareil de perfusion sous pression avec le tampon vasodilatateur (Figure 1A).REMARQUE: Évitez la formation de bulles pour éviter toute perturbation dans le remplissage du produit de contraste. 2. Perfusion Injecter 1 U/g d’héparine dans le PBS dans la cavité intrapéritonéale 30 min avant l’opération. Anesthésiez complètement la souris avec de l’isoflurane et euthanasiez-la par luxation cervicale. Après la décapitation, faites une incision médiane dans le sternum et fixez le thorax ouvert avec des épingles.REMARQUE: Pour éviter les fuites de contraste, évitez de blesser le diaphragme. Coupez l’aorte ascendante et retirez le cœur. Retirez le poumon et exposez l’aorte descendante.REMARQUE: Ne pas blesser l’aorte descendante. Coupez l’aorte descendante en diagonale pour exposer la section transversale (Figure 1B).REMARQUE: Ne pas décoller l’aorte; une section diagonale est préférable pour l’insertion du cathéter. Insérez le cathéter de 22 G dans l’aorte descendante tout en exécutant le tampon de vasodilatation.REMARQUE: L’insertion du cathéter pendant l’exécution du tampon de vasodilatation évite la contamination de l’air. Épinglez la racine du cathéter (Figure 1C). Faites un nœud pour éviter les fuites dues au refoulement. Perfuser une solution vasodilatatrice chauffée (chlorhydrate de papavérine, 4 g/L ; adénosine, 1 g/L ; héparine, 1 U/mL) pendant 3 min à une pression fixe comprise entre 13 et 15 kPa. Perfuser une solution de paraformaldéhyde à 4% dans (PBS) pendant 3 min.REMARQUE: Le succès de la fixation peut être confirmé par le mouvement du pied (Figure 1D). Préparez le produit de contraste juste avant la perfusion.REMARQUE: Ajuster le taux de dilution en fonction de l’échantillon; pour les souris adultes, mélanger la tache et le diluant dans un rapport de 1: 1. Arrêtez la perfusion et remplissez le tube d’extension avec 2 mL de produit de contraste dilué (Figure 1E).REMARQUE: Le produit de contraste doit être injecté lentement pour éviter de blesser les vaisseaux sanguins. Perfuser le produit de contraste à une pression fixe comprise entre 13 et 15 kPa. Pour visualiser les artères, vérifiez l’ongle de l’orteil pour confirmer que le produit de contraste a atteint l’artère (Figure 1F). Pour visualiser tous les vaisseaux, vérifiez la veine cave inférieure du diaphragme pour confirmer la circulation complète du produit de contraste.REMARQUE: Au début, le contraste contient la solution vasodilatatrice; par conséquent, sa bonne circulation est essentielle. Fermez le robinet d’arrêt à trois voies et retirez le tube (Figure 1G).REMARQUE: Si le robinet d’arrêt à trois voies n’est pas fermé, le contraste s’écoulera vers l’arrière. Incuber l’échantillon pendant la nuit à 4 °C. Retirez la peau et fixez-la dans une solution de formaldéhyde à 10%. 3. Visualisation REMARQUE : Les protocoles de visualisation diffèrent selon le tomodensitomètre. Un tomodensitomètre à rayons X microfocus a été utilisé dans ce protocole. Il est nécessaire d’optimiser la méthode d’imagerie en fonction de chaque tomodensitomètre. Fixez l’échantillon dans un tube de 50 mL contenant du PBS. Placez le tube d’échantillonnage sur la table. Scannez l’échantillon avec une tension de 50 kV et un courant de 600 μA, en assurant une distance focale-centre de 75,2 mm.REMARQUE: Une dimension de 1 voxel était de 28,7 μm x 28,7 μm x 28,7 μm dans ce contexte. Chargez les données d’image acquises avec Fiji, une plate-forme open source pour l’analyse d’images biologiques. Déterminez la valeur du voxel musculaire à l’aide du muscle gastrocnémien. Choisissez le muscle gastrocnémien à l’aide de l’outil rectangle . Vérifiez la moyenne et l’écart-type (ET) de l’histogramme (Analyser | Histogramme). Définissez la densité du voxel musculaire comme moyenne + 2SD du muscle gastrocnémien. Définissez la densité du voxel musculaire comme niveau de seuil inférieur (Image | ajustez | Seuil | Définir | niveau de seuil inférieur).REMARQUE: La zone vasculaire et la zone osseuse restent dans les données binarisées après la définition du seuil.