基于计算机断层扫描的小鼠后肢血管三维可视化的样品制备

所有程序均按照熊本大学动物护理指南（批准参考号。）M30-040/A2020-105），符合美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（出版物号85-23，2011年修订）。 1. 准备工作 准备灌注设备和血管扩张剂缓冲液（4 mg / L盐酸罂粟碱，4 g / L;腺苷，1 g / L;肝素，1 U / mL磷酸盐缓冲盐水（PBS））。注：回流装置和血管扩张剂试剂与Weyers等人报道的相同。 连接22 G导管，2 mL延长管和三向旋塞阀（图1A）。注意：根据动物的大小调整仪表。对于成年C57BL / 6小鼠，22 G是最佳的。 用血管扩张剂缓冲液填充压力灌注装置（图1A）。注意：避免形成气泡，以防止造影剂的填充中断。 2. 灌注 在手术前30分钟将PBS中的1 U / g肝素注射到腹膜腔内。 用异氟醚完全麻醉小鼠，并通过宫颈脱位将其安乐死。 斩首后，在胸骨上做一个中线切口，并用销钉固定开放的胸部。注：为避免对比度泄漏，请避免损坏隔膜。 切除升主动脉并切除心脏。 切除肺部并暴露降主动脉。注意：不要损伤降主动脉。 对角切开降主动脉以露出横截面（图1B）。注意：不要剥离主动脉;对角线切口更适合导管插入。 在运行血管舒张缓冲液时将22 G导管插入降主动脉。注意：在运行血管舒张缓冲液时插入导管可避免空气污染。 固定导管的根部（图1C）。 打个结，防止因回流而漏水。 在13至15 kPa之间的固定压力下，将温热的血管扩张溶液（盐酸罂粟碱，4g / L;腺苷，1 g / L;肝素，1 U / mL）灌注3分钟。 将4%多聚甲醛溶液（PBS）浸入3分钟。注意：固定的成功可以通过脚的运动来确认（图1D）。 在灌注前准备造影剂。注：根据样品调整稀释率;对于成年小鼠，以1：1的比例混合染色剂和稀释剂。 停止灌注并用2mL稀释的造影剂填充延长管（图1E）。注意：造影剂应缓慢注射，以避免损伤血管。 在13至15 kPa之间的固定压力下灌注造影剂。 为了可视化动脉，请检查脚趾甲以确认造影剂已到达动脉（图1F）。 要观察所有血管，请检查隔膜的下腔静脉，以确认造影剂的完整循环。注意：在开始时，造影剂含有血管扩张溶液;因此，它的适当流通至关重要。 合上三向旋塞阀并卸下管子（图1G）。注意：如果三向旋塞阀未闭合，则对比度将向后流动。 将样品在4°C孵育过夜。 去除皮肤并将其固定在10%甲醛溶液中。 3. 可视化 注：可视化协议因 CT 扫描仪而异。该协议中使用了微焦点X射线CT扫描仪。有必要根据每个CT扫描仪优化成像方法。 将样品固定在含有PBS的50 mL管中。 将样品管放在桌子上。 以 50 kV 的电压和 600 μA 的电流扫描样品，确保聚焦到中心距离为 75.2 mm。注：在此设置中，1 体素的尺寸为 28.7 μm x 28.7 μm x 28.7 μm。 使用斐济加载获取的图像数据，斐济是用于生物图像分析的开源平台。 使用腓肠肌确定肌肉体素值。 使用 矩形 工具选择腓肠肌。 检查直方图的均值和标准差 （SD） （分析|直方图）。 将肌肉体素密度定义为腓肠肌的平均值 + 2SD。 将肌肉体素密度设置为较低的阈值水平（图像|调整|阈值|设置|较低的阈值级别）。注意：设置阈值后，血管面积和骨骼面积仍保留在二值化数据中。