Un sistema de explante para estudios de imágenes de lapso de tiempo del ensamblaje de circuitos olfativos en Drosophila

Las neuronas están interconectadas con precisión para formar circuitos esenciales para el correcto funcionamiento del cerebro. Durante más de 100 años, los neurocientíficos han estado tratando de comprender cómo las neuritas se extienden hacia sus objetivos intermedios y finales con extrema precisión. Como resultado, han identificado genes importantes que codifican señales de guía para el desarrollo de procesos neuronales¹. El sistema olfativo de Drosophila proporciona un excelente modelo para investigar este proceso, ya que las neuronas receptoras olfativas (ORN, las neuronas sensoriales primarias) se proyectan a 50 glomérulos identificables con tamaño, forma y posición relativa estereotipados, donde forman conexiones sinápticas con dendritas de 50 tipos de neuronas de proyección de segundo orden (PN), cada una de las cuales envía dendritas a uno de los 50 glomérulos² (Figura 1A ). Por lo tanto, es relativamente fácil identificar fenotipos mutantes a resolución sináptica (glomerular) en el sistema olfativo de la mosca. Esto llevó a descubrimientos de genes importantes que regulan el ensamblaje del circuito olfativo³.

El ensamblaje del circuito olfativo de la mosca se basa en procesos de desarrollo coordinados temporal y espacialmente³. Los ORN y los PN adquieren destinos celulares distintos, que configuran el programa para sus especificidades de cableado. A continuación, las dendritas PN prepatronan el lóbulo antenal (Figura 1B). Los axones de los ORN luego circunnavegan el lóbulo antenal ipsilateral y cruzan la línea media del cerebro para llegar al lóbulo antenal contralateral. Posteriormente, los axones ORN invaden los lóbulos antenales ipsi- y contralaterales y forman sinapsis con dendritas de sus compañeros PNs en glomérulos específicos. Este modelo grueso para el ensamblaje de circuitos olfativos se propuso a partir de la caracterización de muestras fijas a partir de puntos de tiempo intermedios durante el desarrollo. La mala resolución temporal y la incapacidad de seguir los mismos procesos neuronales a través del desarrollo a partir de tejido fijo limitan la comprensión mecanicista del proceso de ensamblaje del circuito.

Es técnicamente difícil vivir los procesos orn y PN in vivo, ya que el proceso de cableado ocurre en la primera mitad de la etapa pupal cuando el lóbulo antenal está rodeado por un cuerpo de grasa opaco dentro de la caja pupal. Por lo tanto, es imposible obtener imágenes directas del circuito olfativo en desarrollo a partir de pupas intactas. Los tejidos disecados cultivados ex vivo pueden eludir la opacidad tisular y se han utilizado con éxito para estudiar el desarrollo neuronal ^4,5,6. El desafío de usar una estrategia de cultivo de explante ex vivo similar para estudiar el cableado neuronal en el cerebro pupal es si recapitula la orientación neuronal precisa en una condición de cultivo. Sobre la base de una condición de cultivo ex vivo previamente informada para el complejo ojo de mosca-cerebro⁷, recientemente se ha desarrollado un explante que contiene todo el cerebro pupal, las antenas y los nervios antenales de conexión intactos, que conserva la orientación precisa del circuito olfativo y puede someterse a imágenes en vivo basadas en microscopía de dos fotones durante hasta 24 h a la frecuencia de cada 20 min⁸ . Aquí, se describe un protocolo detallado del cultivo de explante y las imágenes. El sistema de explante proporciona un método poderoso para estudiar el ensamblaje del circuito olfativo y potencialmente otros circuitos en el cerebro central.