نظام Explant لدراسات التصوير بالفاصل الزمني لتجميع الدوائر الشمية في ذبابة الفاكهة
Summary
يصف هذا البروتوكول إجراء التشريح وحالة الزرع والتصوير الحي لنظام إكسبلانت الهوائيات والدماغ لدراسة تجميع الدائرة الحامية الشمية.
Abstract
~ الخلايا العصبية مترابطة بدقة لتشكيل دوائر ضرورية للوظيفة المناسبة للدماغ. يوفر نظام ذبابة الفاكهة الشمية نموذجا ممتازا للتحقيق في هذه العملية نظرا لأن 50 نوعا من الخلايا العصبية للمستقبلات الشمية (ORNs) من الهوائيات والجس الفكي العلوي تعرض محاورها إلى 50 كبيبات محددة في فص الهوائي وتشكل اتصالات متشابكة مع التشعبات من 50 نوعا من الخلايا العصبية الإسقاط من الدرجة الثانية (PNs). ركزت الدراسات السابقة بشكل أساسي على تحديد الجزيئات المهمة التي تنظم الاستهداف الدقيق في الدائرة الشمية باستخدام الأنسجة الثابتة. هنا ، يتم وصف نظام explant الهوائيات الدماغية الذي يلخص المعالم التنموية الرئيسية لتجميع الدوائر الشمية في الثقافة. من خلال تشريح البشرة الخارجية وتنظيف الأجسام الدهنية غير الشفافة التي تغطي دماغ العذراء النامي ، يمكن جمع صور عالية الجودة للخلايا العصبية المفردة من الأدمغة الحية باستخدام المجهر ثنائي الفوتون. وهذا يسمح بالتصوير بفاصل زمني لاستهداف محور عصبي ORN واحد من الأنسجة الحية. سيساعد هذا النهج في الكشف عن السياقات والوظائف البيولوجية المهمة للخلايا للجينات المهمة التي تم تحديدها مسبقا وتحديد الآليات التي تدعم العملية الديناميكية لتجميع الدائرة.
Introduction
الخلايا العصبية مترابطة بدقة لتشكيل دوائر ضرورية للوظيفة المناسبة للدماغ. لأكثر من 100 عام، يحاول علماء الأعصاب فهم كيفية امتداد الخلايا العصبية نحو أهدافها المتوسطة والنهائية بدقة متناهية. ونتيجة لذلك ، حددوا جينات مهمة تشفر إشارات التوجيه لتطوير العمليات العصبية1. يوفر نظام ذبابة الفاكهة الشمية نموذجا ممتازا للتحقيق في هذه العملية منذ أن قامت الخلايا العصبية ذات المستقبلات الشمية (ORNs ، الخلايا العصبية الحسية الأولية) بمشروع إلى 50 كبيبات يمكن تحديدها ذات حجم وشكل وموضع نسبي نمطي ، حيث تشكل روابط متشابكة مع التشعبات من 50 نوعا من الخلايا العصبية الإسقاط من الدرجة الثانية (PNs) ، كل منها يرسل التشعبات إلى واحدة من 50 كبيبات2 (الشكل 1A ). لذلك ، من السهل نسبيا تحديد الأنماط الظاهرية المتحولة بدقة متشابكة (كبيبي) في نظام الشم الذبابة. أدى ذلك إلى اكتشاف جينات مهمة تنظم تجميع الدوائر الشمية3.
يعتمد تجميع الدائرة الشمية الذبابة على عمليات تنموية منسقة زمنيا ومكانيا3. تكتسب ORNs و PNs مصائر خلوية متميزة ، والتي تعد البرنامج لخصائص الأسلاك الخاصة بها. بعد ذلك ، تقوم التشعبات PN بنمط فص الهوائي مسبقا (الشكل 1B). ثم تدور محاور ORNs حول فص الهوائي الجانبي وتعبر خط الوسط للدماغ للوصول إلى فص الهوائي المقابل للجانبي. في وقت لاحق ، تغزو محاور ORN كلا من فصوص الهوائيات ipsi و contralateral وتشكل نقاط اشتباك عصبي مع تشعبات شريكها PNs في كبيبات محددة. تم اقتراح هذا النموذج الخشن لتجميع الدوائر الشمية بناء على توصيف العينات الثابتة من نقاط زمنية وسيطة أثناء التطوير. إن ضعف الدقة الزمنية وعدم القدرة على متابعة نفس العمليات العصبية عبر التطور من الأنسجة الثابتة يحد من الفهم الميكانيكي لعملية تجميع الدائرة.
من الصعب تقنيا أن تعيش عمليات ORN و PN للصور في الجسم الحي لأن عملية الأسلاك تحدث في النصف الأول من مرحلة العذراء عندما يكون الفص الهوائي محاطا بجسم دهني غير شفاف داخل علبة العذراء. لذلك ، من المستحيل تصوير الدائرة الشمية النامية مباشرة من الشرانق السليمة. يمكن للأنسجة المشوهة المستزرعة خارج الجسم الحي التحايل على عتامة الأنسجة وقد تم استخدامها بنجاح لدراسة التطور العصبي4،5،6. التحدي المتمثل في استخدام استراتيجية مماثلة لزراعة الخلايا خارج الجسم الحي لدراسة الأسلاك العصبية في دماغ العذراء هو ما إذا كانت تلخص استهداف الخلايا العصبية الدقيقة في حالة الثقافة. استنادا إلى حالة زراعة خارج الجسم الحي تم الإبلاغ عنها سابقا لمجمع العين والدماغ الذبابة7 ، تم مؤخرا تطوير إكسبلانت يحتوي على الدماغ العذراوي بأكمله والهوائيات والأعصاب الهوائية المتصلة سليمة ، والتي تحتفظ بالاستهداف الدقيق للدائرة الشمية ويمكن أن تخضع للتصوير الحي القائم على المجهر ثنائي الفوتون لمدة تصل إلى 24 ساعة على تردد كل 20 دقيقة8 . هنا ، يتم وصف بروتوكول مفصل لثقافة explant والتصوير. يوفر نظام explant طريقة قوية لدراسة تجميع الدائرة الشمية والدوائر الأخرى المحتملة في الدماغ المركزي.
Protocol
Representative Results
Discussion
يحتفظ هوائيات ذبابة الفاكهة – الدماغ explant بالاستهداف الطبيعي للدائرة الشمية. لقد لاحظنا أن التطور أبطأ 2 مرات خارج الجسم الحي مقارنة بالجسم الحي. ويلاحظ أن نظام explant لا يحتفظ بالجس الفكي العلوي ، الذي يستضيف ستة أنواع من ORNs. لضمان تلخيص التطور الطبيعي خارج الجسم الحي ، يج?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ن. أوزيل و ر. هيسنجر على مشورتهما بشأن ثقافة الإكسبلان. M. فاغنر للمساعدة التقنية من المجهر ثنائي الفوتون. D.J. Luginbuhl لتوليد الذباب المعدلة وراثيا ؛ د. فريدمان للحصول على اقتراحات بشأن تحليل برمجيات فيجي؛ Y. Ge للمساعدة في العمل على الطاير ؛ C. McLaughlin و K.K.L. WONG للتعليق على المخطوطة. ل. ل. هو محقق في معهد هوارد هيوز الطبي. تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة 1K99DC01883001 (إلى T.L.) و R01-DC005982 (إلى L.L.).
Materials
| 20-hydroxyecdysone | Sigma | H5142 | |
| Chameleon Ti:Sapphire laser | Coherent | Coherent MRU X1 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Human insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Imaging software | Prairie | ||
| Micro Scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Oxygen cylinder | Praxair | OX M-E | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Schneider’s Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer | Thermo Fisher Scientific | NC0162601 | |
| Two-photon microscopy | Bruker | ||
| water immerse objective (20X) | Zeiss | 421452-9800-000 |
Referencias
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 3 (6), 001727 (2011).
- Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annual Review Neuroscience. 30, 505-533 (2007).
- Hong, W., Luo, L. Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system. Genética. 196 (1), 17-29 (2014).
- Bentley, D., Caudy, M. Pioneer axons lose directed growth after selective killing of guidepost cells. Nature. 304 (5921), 62-65 (1983).
- Godement, P., Wang, L. C., Mason, C. A. Retinal axon divergence in the optic chiasm: dynamics of growth cone behavior at the midline. Journal of Neuroscience. 14 (11), 7024-7039 (1994).
- Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo. Development. 101 (1), 123-133 (1987).
- Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, 10721 (2015).
- Li, T., et al. Cellular bases of olfactory circuit assembly revealed by systematic time-lapse imaging. Cell. 184, 5107-5121 (2021).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Liu, T. L., et al. Observing the cell in its native state: Imaging subcellular dynamics in multicellular organisms. Science. 360 (6386), (2018).
- Wang, K., et al. Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes. Nature Methods. 11 (6), 625-628 (2014).
- Kohl, J., et al. Ultrafast tissue staining with chemical tags. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111 (36), 3805-3814 (2014).
- Sutcliffe, B., et al. Second-Generation Drosophila Chemical Tags: Sensitivity, Versatility, and Speed. Genética. 205 (4), 1399-1408 (2017).
- Grimm, J. B., Brown, T. A., English, B. P., Lionnet, T., Lavis, L. D. Synthesis of Janelia Fluor HaloTag and SNAP-Tag Ligands and Their Use in Cellular Imaging Experiments. Methods Molecular Biology. 1663, 179-188 (2017).
