Заторможенность вирусов простого герпеса
Summary
Plaquing – это обычный метод, используемый для количественной оценки живых вирусов в популяции. Хотя плакуирование часто преподается в различных учебных программах по микробиологии с бактериями и бактериофагами, плакуирование вирусов млекопитающих является более сложным и трудоемким. Этот протокол описывает процедуры, которые надежно функционируют для регулярной работы с вирусами простого герпеса.
Abstract
Существует множество опубликованных протоколов для успокаивания вирусов, включая ссылки в первичной литературе по методологии. Тем не менее, заражение вирусами может быть трудным для выполнения, требуя сосредоточения внимания на его спецификациях и уточнении. Это невероятно сложный метод для новых студентов, главным образом потому, что он требует тщательного внимания к самым мелким деталям. Эта демонстрация заторможенных вирусов простого герпеса должна помочь тем, кто на протяжении многих лет боролся с визуализацией метода, особенно его нюансов. Хотя эта рукопись основана на тех же принципах стандартной методологии упрочнения, она отличается тем, что содержит подробное описание (1) того, как лучше всего обрабатывать клетки-хозяева, чтобы избежать нарушения во время процесса, (2) более полезную вязкую среду, чем агароза, для ограничения диффузии вирионов и (3) простую процедуру фиксации и окрашивания, которая дает надежно воспроизводимые результаты. Кроме того, сопроводительное видео помогает продемонстрировать более тонкие различия в процессе, которые часто упускаются из виду при инструктаже других о проведении анализов бляшек.
Introduction
Начало анализов вирусных бляшек восходит к первым открытиям вирусов в 1890-х годах1. Вирус табачной мозаики сначала был выделен и передан на листьях табака, где отдельные пятна инфекции могли быть распознаны и количественно определены как происходящие от одного живого вирусного образования2, позже идентифицированного как вирион2. Более поздние семенные исследования с бактериями и бактериофагами усовершенствовали методы, используемые для бляшек этих вирусов, включая бактерии в середине фазы роста, последовательное разбавление образцов бактериофагов и верхний агар с последующей визуализацией буквальных отверстий (называемых бляшками) в бактериальном газоне3.
Размещение вирусов животных отставало от захватывающих исследований, проводимых с бактериофагами, главным образом потому, что методы, необходимые для выращивания клеток млекопитающих в культуре, не были разработаны до 1940-х годов. Однако появление растущих мышиных клеток в отсутствие всего организма-хозяина4 породило новую эру в способности культивировать и подсчитывать вирусы. Такая работа была расширена для распространения и количественного определения вируса энцефаломиелита западных лошадей в клетках кур и полиовируса в клетках человека5,6. По мере того, как область культивируемых клеток млекопитающих расширялась, множество различных клеток-хозяев для различных вирусных инфекций дало миру рог изобилия возможностей для изучения всевозможных вирусов7. Это включало распространение и количественную оценку вирусов герпеса человека, особенно вируса простого герпеса-1 (ВПГ-1) и -2 (ВПГ-2), которые вызывают поражения слизистой оболочки8. Важно отметить, что все анализы бляшек зависят от существования живых вирионов, которые могут проникать в клетки-хозяева рецепторно-опосредованным образом в образце9. Несмотря на повсеместное распространение и множество публикаций по выполнению анализов бляшек5,10,11,12,13,14,15,16, эти методы для ВПГ-1/-2 представляют собой смесь как искусства, так и науки; невозможно провести анализ без должного внимания к каждой детали протокола, равно как и нельзя выполнить успешный анализ без критического взгляда на тонкость в процессе. В этой рукописи изображен один из наиболее последовательно воспроизводимых методов анализа Бляшек ВПГ-1/-2 с точными деталями искусства анализа, которые редко обсуждаются.
Этот текущий протокол надежно получает количество живых бляшек (PFU) для ВПГ-1 и -2. Наилучшие результаты получены с использованием клеток Vero (трансформированных эпителиальных клеток почек африканской зеленой обезьяны) при низком пассаже (ниже числа пассажа 155) и обычно выращиваются в альфа-MEM17 с добавлением 10% сыворотки плодного теленка (FCS), L-аланил-L-глутамина и смеси антибиотика / антимикотики18. Клетки Веро стандартно размножаются в этой среде два-три раза в неделю в 1/5 разведения каждый раз.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя анализы бляшек почти так же стары, как и сама культура клеток млекопитающих, кажется, что каждая лаборатория имеет свой собственный набор протоколов для выполнения этого базового анализа5,6,10,11,12,13,14,15,16,20<sup c…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим бесчисленное количество студентов в наших лабораториях (PJD и BJM), которые работали с нами на протяжении многих лет, совершенствуя эти методы. Отдельное спасибо Стэну Персону, под опекой которого эта методика была впервые разработана. Эта работа была частично поддержана Фондом поддержки исследований бакалавриата Университета Тоусона Fisher College of Science and Math и грантом NIGMS Bridges to the Baccalaureate 5R25GM058264. Этот контент является исключительной ответственностью авторов и не обязательно представляет официальную точку зрения Национального института общих медицинских наук Национального института здравоохранения.
Materials
| 12-well plates | Corning | 3512 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Alpha-MEM | Lonza | 12169F | |
| Antibiotic/antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| Crystal violet | Alfa Aesar | B2193214 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++) | Gibco | 14190144 | |
| Fetal calf serum | Millipore-Sigma | TMS-013-B | |
| L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Gibco | GS07F161BA | |
| Hemacytometer | Thermo Fisher | 02-671-54 | |
| Methylcellulose | Millipore-Sigma | 27-441-0 | |
| Quaternary agent (Lysol I.C.) | Thermo Fisher | NC9645698 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 |
Referencias
- Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. . Introduction to Moden Virology. 6th end. , (2007).
- Mahy, B., Collier, L. . Topley and Wilson’s Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, (1998).
- Anderson, B., et al. Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays. Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).
- Earle, W. R., et al. Production of malignancy in vitro; IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. Journal of the National Cancer Institute. 4 (2), 165-212 (1943).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 273-279 (1953).
- Enders, J. F., Weller, T. H., Robbins, F. C. Cultivation of the lansing strain of poliomyelitis virus in cultures of various human embryonic tissues. Science. 109 (2822), 85-87 (1949).
- Enders, J. F. Cytopathology of virus infections: particular reference to tissue culture studies. Annual Review of Microbiology. 8, 473-502 (1954).
- Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., Knipe, D. M., et al. . Fields Virology. 1, 1823-1897 (2013).
- Madavaraju, K., Koganti, R., Volety, I., Yadavalli, T., Shukla, D. Herpes simplex virus cell entry mechanisms: An update. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 617578 (2020).
- Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Advances in Virus Research. 8, 319-378 (1961).
- Farnham, A. E. The formation of microscopic plaques by herpes simplex virus in HeLa cells. Virology. 6 (2), 317-327 (1958).
- Garabedian, G. A., Scott, L. V. Plaque assay for herpes simplex virus in L-929 (Earle) mouse fibroblasts. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 126 (2), 568-571 (1967).
- Lancz, G. J. Herpes simplex viruses types 1 and 2. Type and strain specific characteristics affecting virus plaque formation. Arch Gesamte Virusforsch. 46 (1-2), 36-43 (1974).
- Muratore, O., Tonoli, E. L., Pesce Schito, A. A short-term plaque assay for antiviral drug research on herpes simplex virus type 2. New Microbiologica. 19 (3), 257-261 (1996).
- Sato, S., Kaneki, H., Shirai, J., Takahashi, K., Kawana, R. Differentiation of herpes simplex virus types 1 and 2 by plaque appearances on semicontinuous rabbit lens epithelial cells in the clinical laboratory. Kansenshogaku Zasshi. 67 (6), 561-573 (1993).
- Yazaki, S., Taniguchi, S., Yoshino, K. Improvement of the plaque assay of herpes simplex virus in HeLa cells. Japanese Jouranl of Microbiology. 10 (3), 133-139 (1966).
- Stanners, C. P., Eliceiri, G. L., Green, H. Two types of ribosome in mouse-hamster hybrid cells. Nature New Biology. 230 (10), 52-54 (1971).
- Giannasca, N. J., Suon, J. S., Evans, A. C., Margulies, B. J. Matrix-based controlled release delivery of acyclovir from poly-(ethylene co-vinyl acetate) rings. Journal of Drug Delivery Science and Technology. 55, 101391 (2020).
- Freshney, R. I. . Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. 7th edn. , (2016).
- Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 38 (8), 747-752 (1952).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virology Journal. 3, 63 (2006).
- Culley, S., Towers, G. J., Selwood, D. L., Henriques, R., Grove, J. Infection counter: Automated quantification of in vitro virus replication by fluorescence microscopy. Viruses. 8 (7), 201 (2016).
- Hudu, S. A., et al. Quantitative Hepatitis B e antigen: A better predictor of Hepatitis B virus DNA than quantitative Hepatitis B surface antigen. Clinical Laboratory. 64 (4), 443-449 (2018).
- Baltimore, D. RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature. 226 (5252), 1209-1211 (1970).
- Scolnick, E. M., Aaronson, S. A., Todaro, G. J., Parks, W. P. RNA dependent DNA polymerase activity in mammalian cells. Nature. 229 (5283), 318-321 (1971).
- Strick, L. B., Wald, A. Diagnostics for herpes simplex virus: is PCR the new gold standard. Molecular Diagnosis and Therapy. 10 (1), 17-28 (2006).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Jouranl of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Kärber, G. Beitrag zue kollektiven Behandlung pharmakologischer pharmakologischer Reihenversuche. Archiv for Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 162 (4), 480-487 (1931).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).
- Spearman, C. The Method of ‘Right and Wrong Cases’ (Constant Stimuli) without Gauss’s formula. British Journal of Psychology. 2 (3), 227-242 (1908).
- Ryu, W. -. S. . Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. 1st edn. , (2017).
- Burrill, C. P., Strings, V. R., Andino, R. Poliovirus: generation, quantification, propagation, purification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , (2013).
- Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yanguez, E. Propagation and titration of influenza viruses. Methods in Molecular Biology. 1836, 59-88 (2018).
- Baz, M. Zika virus isolation, purification, and titration. Methods in Molecular Biology. 2142, 9-22 (2020).
- Coleman, C. M., Frieman, M. B. Growth and quantification of MERS-CoV infection. Current Protocols in Microbiology. 37 (1), 1-9 (2015).
