Plaquing van Herpes Simplex Virussen
Summary
Plaquing is een routinemethode die wordt gebruikt om levende virussen in een populatie te kwantificeren. Hoewel plaquing vaak wordt onderwezen in verschillende microbiologische curricula met bacteriën en bacteriofagen, is het plaquenten van zoogdiervirussen complexer en tijdrovender. Dit protocol beschrijft de procedures die betrouwbaar functioneren voor regelmatig werk met herpes simplex-virussen.
Abstract
Er zijn tal van gepubliceerde protocollen voor het plaquen van virussen, inclusief verwijzingen in de primaire literatuur voor methodologie. Het paaien van virussen kan echter moeilijk uit te voeren zijn, waardoor de nadruk moet worden gelegd op de specificaties en verfijning ervan. Het is een ongelooflijk uitdagende methode voor nieuwe studenten om onder de knie te krijgen, vooral omdat het nauwgezette aandacht vereist voor de meest minuscule details. Deze demonstratie van het plaquen van herpes simplex-virussen zou degenen moeten helpen die in de loop der jaren hebben geworsteld met het visualiseren van de methode, vooral de nuances ervan. Hoewel dit manuscript is gebaseerd op dezelfde principes van de standaard plaquing-methodologie, verschilt het in die zin dat het een gedetailleerde beschrijving bevat van (1) hoe gastheercellen het beste kunnen worden behandeld om verstoring tijdens het proces te voorkomen, (2) een nuttiger viskeus medium dan agarose om de diffusie van virionen te beperken, en (3) een eenvoudige fixatie- en kleuringsprocedure die betrouwbaar reproduceerbare resultaten oplevert. Bovendien helpt de bijbehorende video de fijnere onderscheidingen in het proces te demonstreren, die vaak worden gemist bij het instrueren van anderen over het uitvoeren van plaque-assays.
Introduction
Het begin van virus plaque assays gaan terug tot de eerste ontdekkingen van virussen in de jaren 18901. Tabaksmozaïekvirus werd voor het eerst geïsoleerd en doorgegeven op tabaksbladeren, waar individuele infectieplekken konden worden herkend en gekwantificeerd als afkomstig van een enkele, levende virusentiteit2, later geïdentificeerd als een virion2. Latere baanbrekende studies met bacteriën en bacteriofagen perfectioneerden de technieken die werden gebruikt om deze virussen te plaqueren, waaronder bacteriën in de mid-log fase van groei, seriële verdunning van bacteriofaagmonsters en top agar met daaropvolgende visualisatie van letterlijke gaten (plaques genoemd) in het bacteriële gazon3.
Plaquing van dierlijke virussen bleef achter bij het opwindende onderzoek dat werd uitgevoerd met bacteriofagen, vooral omdat de methoden die nodig zijn voor het kweken van zoogdiercellen in cultuur pas in de jaren 19404 werden ontwikkeld. De komst van groeiende muizencellen in afwezigheid van het hele gastheerorganisme4 bracht echter een nieuw tijdperk voort in het vermogen om virussen te kweken en te tellen. Dergelijk werk werd uitgebreid voor de verspreiding en kwantificering van western equine encefalomyelitisvirus in kippencellen en poliovirus in menselijke cellen5,6. Naarmate het rijk van kweekbare zoogdiercellen zich uitbreidde, gaf de schare van verschillende gastheercellen voor verschillende virale infecties de wereld een overvloed aan mogelijkheden om allerlei soorten virussen te bestuderen7. Dit omvatte de verspreiding en kwantificering van menselijke herpesvirussen, met name herpes simplex virus-1 (HSV-1) en -2 (HSV-2), die mucocutane laesies veroorzaken8. Belangrijk is dat alle plaque-assays afhankelijk zijn van het bestaan van levende virionen, die gastheercellen op een receptorgemedieerde manier in een monster kunnen binnendringen9. Ongeacht de alomtegenwoordigheid en veelheid aan publicaties over de uitvoering van plaque-assays5,10,11,12,13,14,15,16, zijn deze methoden voor HSV-1/-2 een mix van zowel kunst als wetenschap; men kan de test niet uitvoeren zonder de juiste aandacht voor elk detail in het protocol, noch kan men een succesvolle test uitvoeren zonder een kritisch oog voor subtiliteit in het proces. Dit manuscript toont een van de meest consistent reproduceerbare methoden voor HSV-1 /-2 plaque-assays, met nauwkeurige details over de kunst van de assay die zelden worden besproken.
Dit huidige protocol verkrijgt op betrouwbare wijze live plaquevormende eenheden (PFU) tellingen voor HSV-1 en -2. De beste resultaten worden verkregen met behulp van Vero-cellen (getransformeerde Afrikaanse groene apennierepitheelcellen) bij lage passage (onder passagenummer 155) en routinematig gekweekt in alfa-MEM17 aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS), L-alanyl-L-glutamine en een antibioticum / antimycotisch mengsel18. Vero-cellen worden standaard twee tot drie keer per week in dit medium vermeerderd bij een verdunning van 1/5 telkens.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoewel plaque-assays bijna net zo oud zijn als zoogdiercelkweek zelf, lijkt het erop dat elk laboratorium zijn eigen set protocollen heeft om deze basistest uit te voeren5,6,10,11,12,13,14,15,16,20<sup class="xr…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken talloze studenten in onze laboratoria (PJD en BJM) die in de loop der jaren met ons hebben samengewerkt om deze methoden te verfijnen. Een speciale dank aan Stan Person, onder wiens voogdij deze methodologie voor het eerst werd ontwikkeld. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het Towson University Fisher College of Science and Math Undergraduate Research Support fund en NIGMS Bridges to the Baccalaureate grant 5R25GM058264. Deze inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health.
Materials
| 12-well plates | Corning | 3512 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Alpha-MEM | Lonza | 12169F | |
| Antibiotic/antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| Crystal violet | Alfa Aesar | B2193214 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++) | Gibco | 14190144 | |
| Fetal calf serum | Millipore-Sigma | TMS-013-B | |
| L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Gibco | GS07F161BA | |
| Hemacytometer | Thermo Fisher | 02-671-54 | |
| Methylcellulose | Millipore-Sigma | 27-441-0 | |
| Quaternary agent (Lysol I.C.) | Thermo Fisher | NC9645698 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 |
Referencias
- Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. . Introduction to Moden Virology. 6th end. , (2007).
- Mahy, B., Collier, L. . Topley and Wilson’s Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, (1998).
- Anderson, B., et al. Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays. Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).
- Earle, W. R., et al. Production of malignancy in vitro; IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. Journal of the National Cancer Institute. 4 (2), 165-212 (1943).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 273-279 (1953).
- Enders, J. F., Weller, T. H., Robbins, F. C. Cultivation of the lansing strain of poliomyelitis virus in cultures of various human embryonic tissues. Science. 109 (2822), 85-87 (1949).
- Enders, J. F. Cytopathology of virus infections: particular reference to tissue culture studies. Annual Review of Microbiology. 8, 473-502 (1954).
- Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., Knipe, D. M., et al. . Fields Virology. 1, 1823-1897 (2013).
- Madavaraju, K., Koganti, R., Volety, I., Yadavalli, T., Shukla, D. Herpes simplex virus cell entry mechanisms: An update. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 617578 (2020).
- Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Advances in Virus Research. 8, 319-378 (1961).
- Farnham, A. E. The formation of microscopic plaques by herpes simplex virus in HeLa cells. Virology. 6 (2), 317-327 (1958).
- Garabedian, G. A., Scott, L. V. Plaque assay for herpes simplex virus in L-929 (Earle) mouse fibroblasts. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 126 (2), 568-571 (1967).
- Lancz, G. J. Herpes simplex viruses types 1 and 2. Type and strain specific characteristics affecting virus plaque formation. Arch Gesamte Virusforsch. 46 (1-2), 36-43 (1974).
- Muratore, O., Tonoli, E. L., Pesce Schito, A. A short-term plaque assay for antiviral drug research on herpes simplex virus type 2. New Microbiologica. 19 (3), 257-261 (1996).
- Sato, S., Kaneki, H., Shirai, J., Takahashi, K., Kawana, R. Differentiation of herpes simplex virus types 1 and 2 by plaque appearances on semicontinuous rabbit lens epithelial cells in the clinical laboratory. Kansenshogaku Zasshi. 67 (6), 561-573 (1993).
- Yazaki, S., Taniguchi, S., Yoshino, K. Improvement of the plaque assay of herpes simplex virus in HeLa cells. Japanese Jouranl of Microbiology. 10 (3), 133-139 (1966).
- Stanners, C. P., Eliceiri, G. L., Green, H. Two types of ribosome in mouse-hamster hybrid cells. Nature New Biology. 230 (10), 52-54 (1971).
- Giannasca, N. J., Suon, J. S., Evans, A. C., Margulies, B. J. Matrix-based controlled release delivery of acyclovir from poly-(ethylene co-vinyl acetate) rings. Journal of Drug Delivery Science and Technology. 55, 101391 (2020).
- Freshney, R. I. . Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. 7th edn. , (2016).
- Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 38 (8), 747-752 (1952).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virology Journal. 3, 63 (2006).
- Culley, S., Towers, G. J., Selwood, D. L., Henriques, R., Grove, J. Infection counter: Automated quantification of in vitro virus replication by fluorescence microscopy. Viruses. 8 (7), 201 (2016).
- Hudu, S. A., et al. Quantitative Hepatitis B e antigen: A better predictor of Hepatitis B virus DNA than quantitative Hepatitis B surface antigen. Clinical Laboratory. 64 (4), 443-449 (2018).
- Baltimore, D. RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature. 226 (5252), 1209-1211 (1970).
- Scolnick, E. M., Aaronson, S. A., Todaro, G. J., Parks, W. P. RNA dependent DNA polymerase activity in mammalian cells. Nature. 229 (5283), 318-321 (1971).
- Strick, L. B., Wald, A. Diagnostics for herpes simplex virus: is PCR the new gold standard. Molecular Diagnosis and Therapy. 10 (1), 17-28 (2006).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Jouranl of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Kärber, G. Beitrag zue kollektiven Behandlung pharmakologischer pharmakologischer Reihenversuche. Archiv for Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 162 (4), 480-487 (1931).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).
- Spearman, C. The Method of ‘Right and Wrong Cases’ (Constant Stimuli) without Gauss’s formula. British Journal of Psychology. 2 (3), 227-242 (1908).
- Ryu, W. -. S. . Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. 1st edn. , (2017).
- Burrill, C. P., Strings, V. R., Andino, R. Poliovirus: generation, quantification, propagation, purification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , (2013).
- Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yanguez, E. Propagation and titration of influenza viruses. Methods in Molecular Biology. 1836, 59-88 (2018).
- Baz, M. Zika virus isolation, purification, and titration. Methods in Molecular Biology. 2142, 9-22 (2020).
- Coleman, C. M., Frieman, M. B. Growth and quantification of MERS-CoV infection. Current Protocols in Microbiology. 37 (1), 1-9 (2015).
