Melhorando o conteúdo do tumor através da macrodisseção do tumor

Os tecidos FFPE são frequentemente misturas heterogêneas de tecidos tumorais e não tumorais. Testes genômicos de alta sensibilidade estão se tornando cada vez mais prevalentes em ambientes clínicos e de pesquisa, mas podem ser confundidos pela presença de tecido não tumoral contaminante. De fato, um teor mínimo de tumor de 60% é frequentemente recomendado para estudos genômicos. O tumor percentual pode ser determinado pela área de tecido ocupada pelo material tumoral ou pela proporção de células tumorais dentro do tecido. Embora o tumor por área seja uma métrica comumente usada para a pureza do tumor, nem sempre retrata uma descrição precisa do tecido. Considere dois tecidos, ambos com 1000 células, dos quais 500 são células tumorais. No tecido A, as 500 células não tumorais são células estromamicanas com volumes semelhantes aos da célula tumoral. Nesse tecido, o percentual de tumor pode ser considerado 50% tanto pela celularidade quanto pela área. No tecido B, as 500 células não tumorais são células de gordura com volumes que são 4x que a célula tumoral. Nesse tecido, o percentual de tumor ainda é de 50% por celularidade, mas 20% por área. Um terceiro tecido, tecido C, é composto por 500 células tumorais mais 400 células de gordura e 800 células estrômicas com volumes que são 4x e 0,5x que as células tumorais, respectivamente. Dado que 100 células de gordura equivalem ao volume de 800 células estromas, a porcentagem de tumor de tecido C é de 29% por celularidade (500/1700), mas ainda 20% por área. O tecido D também é composto por células tumorais, gordura e estroma, com proporções de volume de 1x, 4x e 0,1x. No entanto, o número de células é de 400, 10 e 720, respectivamente. Assim, o percentual de tumor de tecido D é de 35% por celularidade (400/1130), mas 78% por área. Esses exemplos são excessivamente simplistas e não refletem composições teciduais do mundo real, mas transmitem claramente a importância da composição tecidual e a diferença entre o conteúdo tumoral por área e pela celularidade. É importante ressaltar que, quando se trata de enriquecer o conteúdo tumoral para extração de ácido nucleico a jusante, a celularidade tumoral é o atributo mais importante devido ao potencial de confusão aumentado de extrair material genômico de mais células não tumorais do que as células tumorais. Isso não apenas reforça a necessidade de avaliar o conteúdo tumoral dos tecidos em termos de porcentagem de celularidade, mas também a necessidade de extirto de tecido indesejado, a fim de minimizar eventuais efeitos negativos do tecido não tumoral. Existem vários métodos disponíveis para enriquecimento tecidual, sendo os principais macrodisseção e microdisseção.

A macrodisseção, método descrito neste protocolo, é relativamente rápida, simples e não requer equipamentos caros ou especializados. Embora a macrodisseção possa melhorar muito o conteúdo tumoral, é importante entender que ele não elimina completamente o material não tumoral. O objetivo da macrodisseção é enriquecer o tecido de interesse suficientemente através da exclusão de tecido indesejado, a fim de reduzir o “ruído” decorrente do tecido indesejado, que por sua vez pode aumentar o sinal de interesse do tecido de interesse. Assim, o enriquecimento tumoral mediado pela macrodisseção é uma maneira de aumentar a relação sinal-ruído, a fim de detectar melhor marcadores de interesse, particularmente marcadores moleculares específicos do tumor com baixa abundância ou má expressão. No entanto, a macrodisseção tem limitações devido à falta de precisão oferecida por ferramentas grosseiras, como lâminas de barbear e é suscetível a questões de precisão decorrentes da espessura da linha do marcador do patologista, bem como possíveis erros ao rastrear as demarcações H&E dos patologistas. Como aludido acima, não é possível alcançar 100% de pureza tumoral devido à presença de elementos estromais inerentes e indutores de tumores (ou seja, tecido conjuntivo, fibroblastos estrômicos, vasos sanguíneos, linfócitos reativos benignos, macrófagos) incorporados dentro do próprio tumor. De fato, muitas malignidades invasivas ou difusivamente infiltrativas induzem uma resposta estromal desmoplástica robusta, resultando em aglomerados de células tumorais que são intimamente misturadas com fibroblastos estrômicos e outros tipos de células não neoplásicas; onde tumores associados a esse padrão de reação estroma, como os tecidos de câncer de pâncreas²¹, podem se beneficiar mais da microdisseção digitalmente guiada do que da macrodisseção manual.

A microdisseção manual é realizada sob um microscópio para auxiliar na identificação, dissecção e isolamento de tecidos de células específicas ou populações usando uma agulha ou bisturi e tem a vantagem de aumentar a precisão sobre a macrodisseção²². No entanto, a microdissecção manual é um processo trabalhoso que carece da finesse necessária para tecidos complexos com baixo teor de tumor ou características intrincadas que são incompatíveis com dissecção manual. Esses tecidos podem ser dissecados usando métodos automatizados de alta precisão, como microdisseção de captura de laser. De fato, a microdissecção digitalmente guiada tem se mostrado que produz conteúdo de tumor percentual maior em comparação com a macrodisseção manual nos tecidos de câncer de pâncreas²³. No entanto, as desvantagens desses métodos automatizados de alta precisão, como a necessidade de equipamentos especializados, caros e indivíduos altamente treinados, têm dificultado sua incorporação em fluxos de trabalho. Um estudo realizado por de Bruin et al. comparando os efeitos da macrodisseção e microdisseção de captura a laser (LCM) no perfil de expressão genética descobriu que as amostras de LCM tinham baixo rendimento total de RNA (média de 30 ng) e necessitavam de duas rodadas de amplificação de mRNA para atender ao limiar de entrada de preparação da biblioteca cDNA²⁴. Os autores descobriram que os perfis resultantes de expressão genética LCM foram afetados pelas rodadas de amplificação do mRNA mais do que perfis macrodissectados foram afetados por contribuições estrômicas não tumorais e concluíram que a macrodisseção poderia ser adequadamente utilizada para gerar dados confiáveis de expressão genética²⁴.

Uma vantagem significativa do perfil de expressão genética digital NanoString, particularmente quando se trabalha com RNA derivado de FFPE altamente degradado, é que ele não requer processos dependentes enzimáticos, como amplificação de RNA ou preparação de bibliotecas cDNA. No entanto, os ensaios são tipicamente otimizados para insumos entre 50-300 ng do total de RNA ^25,26, que, com base nos achados de De Bruin et ^al.24, podem não ser compatíveis com tecidos microdisstados sem aumentar a entrada de tecido; uma demanda desfavorável em uma era onde amostras de tecido são cada vez mais coletadas como pequenas biópsias em vez de ressecções cirúrgicas. As entradas de RNA utilizadas para o ensaio DLBCL90 variaram de 68,5-300 ng para os tecidos macrodissectados e não dissecados. Os resultados mostram que a macrodisseção resultou em alterações de chamada em 60% das amostras examinadas e que essas alterações foram observadas independentemente da entrada de RNA das amostras macrodissectadas. No entanto, a probabilidade de COO para a entrada de RNA baixa invadiu o limiar de chamada de probabilidade COO GCB/UNC, onde os limiares são de 0 a 0,9 a 1,0 para o ABC chama²⁰. Os principais subtipos de COO da DLBCL são o GCB e o ABC, que representam 41% e 44% de todos os casos de DLBCL, com a UNC representando um grupo intermediário dos dois e o ABC sendo o mais agressivo^20,27. Assim, embora a mudança de chamada de COO na macrodisseção da amostra C não tenha causado uma mudança franca no subtipo de COO de GCB para ABC, a mudança do GCB para a UNC pode sugerir uma mudança para uma doença mais agressiva. Além disso, estudos recentes indicam que o subtipo unc não é simplesmente um subtipo intermediário e que pode potencialmente possuir atributos terapeuticamente exploráveis subtipo²⁸. Da mesma forma, a macrodisseção das amostras A e E não causou alterações francas nas chamadas DHITsig de DH negativo para DH positivo, ou vice-versa. No entanto, os movimentos de uma amostra de GCB (amostra A) de NEG para UNCLASS e uma amostra de ABC (amostra E) da UNCLASS para neg após a macrodisseção são biologicamente apropriados, pois translocações de duplo impacto envolvendo BCL2 são relatadas como um fenômeno GCB exclusivamente^{GCB 19}. Embora as translocações sejam tradicionalmente e onipresentemente detectadas pelo FISH em ambientes clínicos, há um impulso crescente para identificar um método alternativo menos envolvido e demorado para sua detecção. O ensaio DLBCL90 é uma ferramenta importante que aborda essa necessidade, onde a lógica para seu uso é reforçada pela constatação de que este ensaio é capaz de detectar translocações enigmáticas para sondas FISH utilizadas no diagnóstico clínico²⁹.

O protocolo de macrodisseção descrito acima descreve um método simples que permite aos pesquisadores aumentar o conteúdo tumoral de amostras de tecido que normalmente ficariam abaixo dos limites de critérios de inclusão do estudo comumente usados. A macrodisseção em um fluxo de trabalho de estudo permite que os pesquisadores resgatem tecidos mal tumorais densos da exclusão do estudo, aumentando seu conteúdo tumoral. Por sua vez, isso permite maior confiança de que os elunatos de RNA e DNA resultantes representam o tumor sob investigação genômica. Embora existam outros métodos mais precisos para dissecção tecidual, para tumores que crescem de forma mais expansiva, não-infiltrativa, semelhante a folhas ou sólidas, a macrodisseção é provavelmente suficiente. Os resultados aqui apresentados destacam a importância da pureza tumoral em ensaios genômicos e macrodisseção como uma ferramenta confiável para isso.