Denne protokollen presenterer en metode for å øke prosentandelen tumorinnhold i formalin-faste parafin-innebygde vevsprøver.
Tilstedeværelsen av forurensende ikke-tumorvev i formalin-fast parafin-innebygd (FFPE) vev kan i stor grad undergrave genomiske studier. Her beskriver vi makrodisseksjon, en metode designet for å øke det prosentvise tumorinnholdet i en vevsprøve ved å fjerne og eliminere uønsket vev før du utfører nedstrøms nukleinsyreekstraksjoner. FFPE vevsblokker ble seksjonert for å produsere 4-5 μm lysbildemonterte vevsseksjoner. En representativ seksjon ble sendt inn for hematoksylin og eosin (H&E) farging og deretter gjennomgått av en styresertifisert patolog. Under gjennomgangen identifiserte og markerte patologen regionene av tumorvev i H&E. Når den er fullført, ble den avmerkede H&E brukt til å lede reseksjon av de serielle unstained seksjonene fra samme vevsblokk. For å demonstrere effekten av makrodisseksjon ble RNA hentet fra samsvarende makro uoppdaget og ikke-dissekert Diffuse Large B-Cell Lymphomas (DLBCL) kjørt på en digital genuttrykksanalyse som kunne bestemme DLBCL-undertype og BCL2-translokasjonsstatus. Resultatene viste at makrodisseksjon endret subtype- eller BCL2-translokasjonsstatuskallene i 60 % av de undersøkte prøvene. Til slutt er makrodisseksjon en enkel og effektiv metode for å utføre tumorberikelse før nukleinsyreutvinninger, hvis produkt deretter trygt kan brukes i nedstrøms genomiske studier.
Formalin-fast parafin-innebygd (FFPE) vev, samlet som en del av den normale kliniske diagnostiske prosessen og beholdt i kliniske vev repositorier, representerer en stor ressurs for menneskelig forskning, inkludert kreft forskning1. Etter hvert som vår forståelse av menneskelig sykdom utdypes, blir det stadig tydeligere at sykdommer, tidligere antatt å være enkeltenheter basert på morfologiske og immunofenotypiske egenskaper, faktisk består av distinkte molekylære undertyper som krever molekylære subtypinganalyser. Følgelig har høysensitive genomiske analyser som er i stand til å skjelne disse undertypene blitt stadig viktigere2. Selv om FFPE-vev er kjent for å være dårlig kompatibelt med genomiske teknikker på grunn av fikseringsrelaterte problemer, etter hvert som teknologi og protokoller utvikler seg, blir disse teknikkene stadig mer kompatible med dette klinisk allestedsnærværende vevsformatet 3,4,5. Imidlertid er FFPE-vev ofte blandinger av tumor- og ikke-tumorvevsmaterialer, hvor tilstedeværelsen av ikke-tumormateriale ofte er uønsket og kan, hvis det er tilstede med høy andel, undergrave og påvirke resultatene av genomiske analyser6 betydelig. Faktisk brukes et minimum tumorinnhold på 60% ofte til slike analyser, hvor vev som faller under denne terskelen kan utelukkes, til tross for at de ellers oppfyller studiekriteriene7. Dette kan være spesielt problematisk i sjeldne sykdomsmiljøer, hvor pasientvev er dyrebart og vanskelig å samle i høye tall.
Makrodesisseksjon er en metode som minimerer effekten av lavt tumorinnhold ved å redusere mengden normalt vev3. Fjerningen av slikt forvirrende ikke-tumormateriale før nukleinsyreutvinning kan øke tumorprosentinnholdet betydelig og dermed tumorrenheten til de ekstraherte nukleinsyrene. Vevsreseksjon er kritisk avhengig av ekspert patologisk gjennomgang, hvor svulstregionen identifiseres og sirkles på en nygenerert hematoksylin og eosin (H&E) farget vevsseksjon av en brettsertifisert patolog8. Den sirklede H&E brukes deretter til å lede fjerning og innsamling av henholdsvis uønsket vev og målvev. Denne protokollen beskriver trinnene i makrodisseksjon fra patologisk gjennomgang gjennom vevshøsting som utført ved AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) Technical Core Laboratory ved Mayo Clinic.
FFPE vev er ofte heterogene blandinger av tumor og ikke-tumor vev. Høysensitive genomiske tester blir stadig mer utbredt i både kliniske og forskningsmiljøer, men kan forvirres av tilstedeværelsen av forurensende ikke-tumorvev. Faktisk anbefales et minimum tumorinnhold på 60% ofte for genomiske studier. Prosent svulst kan bestemmes av vevsområdet okkupert av tumormaterialet eller av andelen tumorceller i vevet. Selv om svulst etter område er en vanlig brukt beregning for tumorrenhet, skildrer den ikke alltid en nøyaktig beskrivelse av vevet. Vurder to vev, begge med 1000 celler, hvorav 500 er tumorceller. I vev A er de 500 ikke-tumorcellene stromale celler med lignende volumer som tumorcellen. I dette vevet kan prosentandelen av svulst betraktes som 50% av både cellulæritet og område. I vev B er de 500 ikke-tumorcellene fettceller med volumer som er 4 ganger svulstcellens. I dette vevet er den prosentvise svulsten fortsatt 50% av cellulæriteten, men 20% etter område. Et tredje vev, vev C, består av 500 tumorceller pluss 400 fettceller og 800 stromale celler med volumer som er henholdsvis 4x og 0,5x av tumorcellene. Gitt 100 fettceller tilsvarer volumet av 800 stromale celler, er den prosentvise svulsten i vev C 29% ved cellulæritet (500/1700), men fortsatt 20% etter areal. Vev D består også av tumor-, fett- og stromalceller med volumforhold på 1x, 4x og 0,1x. Antall celler er imidlertid henholdsvis 400, 10 og 720. Dermed er den prosentvise svulsten i vev D 35% ved cellulæritet (400/1130), men 78% etter areal. Disse eksemplene er altfor forenklede og gjenspeiler ikke virkelige vevssammensetninger, men formidler tydelig viktigheten av vevssammensetning og forskjellen mellom tumorinnhold etter område og cellulæritet. Viktig, når det gjelder berikende tumorinnhold for nedstrøms nukleinsyreutvinning, er tumor cellulæritet den viktigste egenskapen på grunn av det økte forvirrende potensialet for å trekke ut genomisk materiale fra mer ikke-tumorceller enn tumorceller. Dette understreker ikke bare behovet for å vurdere tumorinnholdet i vev når det gjelder prosentandel cellulæritet, men også behovet for å utskille uønsket vev for å minimere potensielle negative effekter av ikke-tumorvevet. Det finnes flere metoder for vevsberikelse, der de viktigste er makrodeseksjon og mikrodesinfeksjon.
Makrodissection, metoden beskrevet i denne protokollen, er relativt rask, enkel og krever ikke kostbart eller spesialisert utstyr. Selv om makrodisseksjon i stor grad kan forbedre tumorinnholdet, er det viktig å forstå at det ikke helt eliminerer ikke-tumormateriale. Formålet med makrodisseksjon er å berike vevet av interesse tilstrekkelig gjennom utelukkelse av uønsket vev for å redusere “støyen” som stammer fra uønsket vev, noe som igjen kan forbedre signalet om interesse fra vevet av interesse. Dermed er makrodisseksjon mediert tumorberikelse en måte å forbedre signal-til-støy-forholdet for bedre å oppdage markører av interesse, spesielt tumorspesifikke molekylære markører med lav overflod eller dårlig uttrykk. Imidlertid har makrodisseksjon begrensninger på grunn av mangel på presisjon som tilbys av grove verktøy som barberblader og er utsatt for presisjonsproblemer som stammer fra banetykkelsens markør, samt potensielle feil når du sporer patologene H&E avgrensninger. Som nevnt ovenfor er det ikke mulig å oppnå 100% tumorrenhet på grunn av tilstedeværelsen av iboende og tumorinduserende stromale elementer (dvs. bindevev, stromale fibroblaster, blodkar, godartede reaktive lymfocytter, makrofager) innebygd i selve svulsten. Faktisk induserer mange invasive eller diffust infiltrative maligniteter en robust desmoplastisk stromal respons, noe som resulterer i klynger av tumorceller som er intimt admixed med stromale fibroblaster og andre ikke-neoplastiske celletyper; der svulster forbundet med dette stromale reaksjonsmønsteret, som kreftvev i bukspyttkjertelen21, kan ha mer nytte av digitalt styrt mikrodeseksjon i stedet for manuell makrodisseksjon.
Manuell mikrodisseksjon utføres under et mikroskop for å hjelpe identifisering, disseksjon og isolering av vev bestemte celler eller populasjoner ved hjelp av en nål eller skalpell og har fordelen av økt presisjon over makrodeseksjon22. Imidlertid er manuell mikrodisseksjon en arbeidskrevende prosess som mangler finesse som trengs for komplekse vev med lavt tumorinnhold eller intrikate egenskaper som er uforenlige med manuell disseksjon. Slike vev kan dissekeres ved hjelp av høypresisjons automatiserte metoder som laserfangstmikrodisseksjon. Faktisk har digitalt styrt mikrodeseksjon vist seg å gi høyere prosentandel tumorinnhold sammenlignet med manuell makrodisseksjon i bukspyttkjertelkreftvev23. Ulempene med disse automatiserte metodene med høy presisjon, for eksempel behovet for spesialisert, dyrt utstyr og høyt utdannede personer, har imidlertid hindret innlemmelsen i arbeidsflyter. En studie av de Bruin et al. som sammenlignet effekten av makrodeseksjon og laserfangstmikrodeseksjon (LCM) på genuttrykksprofilering fant at LCM-prøver hadde lave totale RNA-utbytter (30 ng gjennomsnitt) og krevde to runder med mRNA-forsterkning for å oppfylle cDNA-biblioteket prep input threshold24. Forfatterne fant at de resulterende LCM-genuttrykksprofilene ble påvirket av rundene med mRNA-forsterkning mer enn makrodisserte profiler ble påvirket av ikke-tumorstromale bidrag og konkluderte med at makrodisseksjon kunne brukes tilstrekkelig til å generere pålitelige genuttrykksdata24.
En betydelig fordel med NanoString digital genuttrykksprofilering, spesielt når du arbeider med svært degradert FFPE-avledet RNA, er at det ikke krever enzymatiske avhengige prosesser som RNA-forsterkning eller utarbeidelse av cDNA-biblioteker. Imidlertid er analyser vanligvis optimalisert for innganger mellom 50-300 ng av totalt RNA25,26, som, basert på funnene fra de Bruin et al.24, kanskje ikke er kompatible med mikrodisserte vev uten å øke vevsinngangen; en ugunstig etterspørsel i en tid der vevsprøver i økende grad samles inn som små biopsier i stedet for kirurgiske reseksjoner. RNA-inngangene som ble brukt til DLBCL90-analysen varierte fra 68,5-300 ng for både det makrodisserte og ikke-dissekerte vevet. Resultatene viser at makrodisseksjon resulterte i kallendringer i 60% av de undersøkte prøvene, og at disse endringene ble observert uavhengig av RNA-inndata fra de makrodisserte prøvene. COO-sannsynligheten for de lave RNA-inngangene brøt imidlertid inn COO GCB/UNC-sannsynlighetskallterskelen, der tersklene er 0 til 0,9 til 1,0 for ABC-kall20. De viktigste DLBCL COO-undertypene er GCB og ABC, som utgjør 41% og 44% av alle DLBCL-tilfeller, med UNC som representerer en mellomgruppe av de to og ABC som de mest aggressive20,27. Selv om COO-utlysningen av makrodeseksjon av prøve C ikke forårsaket en åpenbar endring i COO-undertypen fra GCB til ABC, kan endringen fra GCB til UNC antyde et skifte mot en mer aggressiv sykdom. Videre indikerer nyere studier at UNC-subtypen ikke bare er en mellomliggende undertype, og at den potensielt kan ha subtypespesifikke terapeutisk utnyttbare attributter28. På samme måte forårsaket ikke makrodisseksjon av prøver A og E ærlige endringer i DHITsig-kall fra DH-negativ til DH-positiv, eller omvendt. Imidlertid er bevegelsene til en GCB-prøve (prøve A) fra NEG til UNCLASS og en ABC-prøve (prøve E) fra UNCLASS til NEG ved makrodeseksjon biologisk hensiktsmessig ettersom doble trefftranslokasjoner som involverer BCL2 rapporteres å være et utelukkende GCB-fenomen19. Selv om translokasjoner tradisjonelt og allestedsnærværende oppdages av FISH i kliniske omgivelser, er det et økende momentum for å identifisere et alternativ mindre involvert og tidkrevende metode for deteksjon. DLBCL90-analysen er et viktig verktøy som adresserer dette behovet, der begrunnelsen for bruken styrkes av at denne analysen er i stand til å oppdage translokasjoner kryptisk for FISH-sonder som brukes i klinisk diagnostikk29.
Makrodisseksjonsprotokollen beskrevet ovenfor skisserer en enkel metode som gjør det mulig for forskere å øke tumorinnholdet i vevsprøver som vanligvis vil falle under vanlige studieinklusjonskriterier. Inkludert makrodisseksjon i en studiearbeidsflyt gjør det mulig for forskere å redde dårlig tumortett vev fra studieekskludering ved å øke tumorinnholdet. I sin tur tillater dette økt tillit til at de resulterende RNA- og DNA-eluates representerer svulsten under genomisk undersøkelse. Selv om det finnes andre mer presise metoder for vevs disseksjon, for svulster som vokser i en mer ekspansiv, ikke-infiltrativ, arklignende eller solid måte, er makrodisseksjon sannsynligvis tilstrekkelig. Resultatene som presenteres her fremhever betydningen av tumorrenhet i genomiske analyser og makrodisseksjon som et pålitelig verktøy for å oppnå dette.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet støttes av NIH-finansiert AIDS og Cancer Specimen Resource (ACSR, UM1 CA181255-2) under sitt biospecimen science program. Videoen ble filmet og etterproduksjonsredigering ble utført av Mayo Clinic Media Services.
200-proof ethanol | Decon | 2701 | |
AllPrep DNA/RNA FFPE Kit | Qiagen | 80234 | DNA/RNA FFPE extraction kit |
Coplin pots | Various | x | |
DLBCL90 probes | NanoString | various | Digital gene expression profiling based DLBCL90 assay |
d-Limonene | VWR | 89376-092 | |
Forceps | Various | x | |
Glass micrscope slides | FisherBrand | 12-550-15 | |
Glycerol | VWR | 0854-1L | |
Master kits | NanoString | various | |
Microtome | Leica | RM2265 | |
Microtubes | Ambion | AM12400 | |
NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONE-W | Spectrophotometer for DNA, RNA and protein qualitation |
nCounter | NanoString | x | Digital gene expression profiling platform used to run the DLBCL90 assay |
Permanent marker | Electrib Microscope Sciences | 72109-12 | |
Razor blade dispenser | Electrib Microscope Sciences | 71985-10 | |
Razor blades | Electrib Microscope Sciences | 71985-23 | |
Tissue digestion buffer | Qiagen | 80234 | |
Ultrapure water | VWR | SH30538.02 | |
Waterbath | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
Wooden stick | FisherBrand | 22363158 |