JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioingeniería

Volledig optische mechanobiologie ondervraging van ja-geassocieerd eiwit in menselijke kanker en normale cellen met behulp van een multifunctioneel systeem

Published: December 20, 2021
doi:
10.3791/62934
, , , , , , , , , ,
1Department of Electrical and Computer Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering,University of Florida, 2Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering,University of Florida, 3Department of Electrical and Computer Engineering,University of California, 4Department of Radiation Oncology, College of Medicine,University of Florida, 5UF Health Cancer Center,University of Florida, 6Department of Physics, College of Liberal Arts and Sciences,University of Florida, 7Department of Anatomy and Cell Biology, College of Medicine,University of Florida

Summary

Dit artikel presenteert een gedetailleerd stapsgewijs protocol over het gebruik van een geïntegreerd multifunctioneel en door de gebruiker programmeerbaar systeem dat automatische meerkanaals beeldvorming en mechanobiologische analyse mogelijk maakt om de mechano-gevoeligheid van Ja-geassocieerd eiwit (YAP) op te helderen.

Abstract

Langdurige multifunctionele beeldvorming en analyse van levende cellen vereisen gestroomlijnde, functionele coördinatie van verschillende hardware- en softwareplatforms. Handmatige bediening van verschillende apparatuur die door verschillende fabrikanten wordt geproduceerd, is echter arbeidsintensief en tijdrovend, waardoor de nauwkeurigheid, reproduceerbaarheid en kwaliteit van de verkregen gegevens mogelijk afnemen. Daarom kan een alles-in-één en door de gebruiker programmeerbaar systeem dat automatische, multifunctionele en langdurige beeldacquisitie mogelijk maakt en compatibel is met de meeste fluorescerende microscopieplatforms, de wetenschappelijke gemeenschap ten goede komen. Dit artikel introduceert de volledige operationele protocollen van het gebruik van een nieuw geïntegreerd softwaresysteem dat bestaat uit (1) een zelfgebouwd softwareprogramma, getiteld “Automatic Multi-functional Integration Program (AMFIP),” dat automatische multi-channel imaging-acquisitie mogelijk maakt, en (2) een suite van kwantitatieve beeldvormingsanalyse en celtractieberekeningspakketten.

Dit geïntegreerde systeem wordt toegepast om de voorheen onbekende relatie te onthullen tussen de ruimtelijk-temporele verdeling van mechano-gevoelig Yes-geassocieerd eiwit (YAP) en de celmechanica, inclusief celverspreiding en tractie, in CRISPR / Cas9-engineered menselijke normale cellen (B2B) en longkankercellen (PC9). Gebruikmakend van het vermogen van dit systeem om meerkanaals controle en uitlezing te bieden, laat het resultaat zien: (1) B2B-normale cellen en PC9-kankercellen vertonen een duidelijke relatie tussen YAP-expressie, tractie en celdynamica tijdens celverspreidings- en migratieprocessen; en (2) PC9-kankercellen oefenen merkbare peri-nucleaire krachten toe op substraten. Samenvattend presenteert dit artikel een gedetailleerd stapsgewijs protocol over het gebruik van een geïntegreerd door de gebruiker programmeerbaar systeem dat automatische multifunctionele beeldvorming en analyse mogelijk maakt om YAP-mechanogevoeligheid op te helderen. Deze tools openen de mogelijkheid voor gedetailleerde verkenningen van veelzijdige signaaldynamica in de context van celfysiologie en pathologie.

Introduction

Het algemene doel van deze methode is om volledig optische multifunctionele beeldvorming en analyse van levende cellen mogelijk te maken. Een alles-in-één beeldvormingsprogramma dat de automatische coördinatie van multifunctionele opto-elektronische apparaten mogelijk maakt, vermindert arbeidsintensieve en foutgevoelige handmatige bewerkingen en is essentieel voor onderzoekers om langdurige live-cell imaging uit te voeren1,2,3,4. De meeste bestaande openbare programma’s in de biomedische onderzoeksgemeenschap zijn echter alleen van toepassing op beperkte opto-elektronische apparaten of vereisen extra hardware voor de coördinatie van verschillende apparatuur5,6,7,8,9. Onlangs is een open-source en software-gebaseerd programma ontwikkeld, getiteld “Automatic Multi-functional Integration Program (AMFIP),” waardoor multi-channel en time-lapse imaging mogelijk is. Op basis van Java-taal en de Application Programming Interface (API) van μManager11,12, is AMFIP ontwikkeld als een plug-in in μManager die aangepaste Java-scripts uitvoert om softwaregebaseerde communicatie van meerdere opto-elektronische hardware- en softwareplatforms uit te voeren, inclusief maar niet beperkt tot die van Nikon. De oprichting van AMFIP opent de mogelijkheid voor programmeerbare en multifunctionele ondervraging van celgedrag. Een geïntegreerd experimenteel en computationeel systeem wordt ontwikkeld in dit artikel en combineert AMFIP met digitale beeldvormingsanalyse en celtractiekrachtmicroscopie. Het systeem maakt de opheldering van de verschillende YAP-mechanobiologie in CRISPR / Cas9-engineered menselijke normale B2B (figuur 1) en longkanker PC9 (figuur 2) cellijnen mogelijk. Het systeem biedt de wetenschappelijke gemeenschap een uitgebreide oplossing die de vraag vermijdt om extra besturingsapparaten aan te schaffen die mogelijk niet beschikbaar zijn voor en / of compatibel zijn met elk beeldvormingssysteem.

De protocollen die in dit artikel worden gepresenteerd, introduceren hoe (1) AMFIP kan worden toegepast om automatische langetermijnbeeldvorming uit te voeren voor zowel CRISPR / Cas9-engineered cellijnen die mNEonGreen2-tagged YAP uitdrukken; en (2) Fiji ImageJ, MATLAB en Origin combineren voor de kwantitatieve analyse van yap nucleair/cytoplasma (N/C) verhouding op basis van hun fluorescerende intensiteit (figuur 3 es figuur 4), cellulair verplaatsingsveld (figuur 1C es figuur 2C) en cellulair tractieveld (figuur 1D es figuur 2D) ). De resultaten suggereren dat (1) tijdens de eerste 10 uur celverspreiding op de substraten met fysiologisch relevante mechanische stijfheid13,14,15,16,17,18, de YAP N/C-verhouding van enkele B2B-cellen meer merkbare tijdsafhankelijke variatie en fluctuatie vertoont in vergelijking met die van enkele PC9-cellen (figuur 5 es figuur 6). ); en (2) PC9-kankercellen genereren merkbare tractie in hun peri-nucleaire regio’s (figuur 7). Het geïntegreerde systeem en de methodologieën die in dit protocol worden beschreven, overstijgen de specifieke soorten cellen en optogenetische moleculen. Onderzoekers kunnen de protocollen toepassen om hun specifieke live-cell ondervragingsexperimenten aan te passen en veelzijdige signaaldynamiek op te helderen in de context van celfysiologie en pathologie.

Protocol

1. Generatie van stabiele CRISPR/Cas9-bewerkte menselijke longkankercellijn (PC9) en menselijke bronchiale epitheelcellijn (Beas2B) die endogene mNeonGreen21-10/11-tagged YAP-eiwit tot expressie brengen Voer polymerasekettingreactie (PCR) uit om de DNA-sequentie te versterken die codeert voor de 11e streng van het fluorescentie-eiwit, mNeonGreen2, met behulp van het high-fidelity DNA-polymerase (zie de tabel met materialen). Klop de versterkte DNA-sequentie in de YAP-genomische locus van de PC9- en B2B-cellijnen met behulp van het CRISPR-Cas9-genbewerkingssysteem.OPMERKING: Deze DNA-sequentie vult strengen 1-10 mNeonGreen2 aan om fluorescentie uit te stralen. De genomische sequentiekaart van YAP-mNeonGreen21-10/11 is weergegeven in supplementele figuur S1. De kaart bevat de gelabelde genomische, donor- en mNeonGreen2-sequenties. Controleer de crispr/cas9-engineered mNeonGreen2-expressie met behulp van een epifluorescentiemicroscoop (zie de tabel met materialen). Omdat de mNeonGreen2 wordt getagd met YAP wanneer de cellen YAP tot expressie brengen in de context van zijn oorspronkelijke genregulerende netwerk, controleert u de aanwezigheid van de fluorescentie-intensiteit in zowel CRISPR / Cas9-gemanipuleerde cellen en vergelijkt u deze met die in de ouderlijke cellen (controle).OPMERKING: Gebruik om dit protocol te volgen (1) een laser van 488 nm (47,5 mW/mm2) voor excitatie, (2) een objectief van 40x (numeriek diafragma (NA) = 0,95) en een banddoorlaatemissiefilter (ET525/50 nm) voor fluorescentiemeting en (3) ImageJ-software om de fluorescentie-intensiteiten te meten, kwantificeren en vergelijken. Bevestig de juiste integratie van mNeonGreen211 door genomisch DNA uit de CRISPR/Cas9-bewerkte cellijnen te extraheren; voer PCR uit met behulp van primers die de genomische insert en sequencing flankeren om de insertie op de juiste genomische loci19,20 te bevestigen. Sla de mNeonGreen211 neer met behulp van het CRISPR/Cas9-genbewerkingssysteem en controleer de vermindering van de fluorescentie-intensiteit in cellen met dezelfde microscoopsystemen en beeldvormingsparameters die zijn beschreven in stap 1.3.OPMERKING: Deze stap bevestigt de juiste integratie van mNeonGreen211 door de vergelijking van fluorescentie-intensiteiten. De CRISPR/Cas9-engineered cellen zonder knock-down en ouderlijke cellen worden gebruikt als controle. Verzamel de cellen met het gelabelde eiwit van belang door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) sortering. Om cellen voor te bereiden op FACS-sortering, trypsineize ze en resuspend ze in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Verzamel cellen met mNeonGreen2-fluorescentie boven het achtergrondniveau van de ouderlijke cellijnen in twee verrijkende rondes van FACS-sortering.OPMERKING: De tijdlijn voor het genereren van de CRISPR/Cas9-bewerkte cellijnen die hier worden beschreven, ligt in de orde van grootte van 1-2 maanden. Alle cellijnen worden op verzoek openbaar gemaakt, zodat andere onderzoekslaboratoria de resultaten kunnen reproduceren. 2. Onderhoud van PC9- en B2B-cellen Behoud beide cellijnen in bevochtigde weefselkweekincubators met 5% CO2 bij 37 °C. Kweek 106 endogeen getagde PC9- en Beas2B-cellen in kolven van 75 cm2 met 12 ml RPMI-1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 100 μg/ml penicilline-streptomycine. Subcultuur beide cellijnen wanneer de celconfluentie ~80% bereikt. Test beide cellijnen elke 3 maanden op mycoplasma met behulp van een mycoplasma-detectiekit, waarbij alle door de fabrikant aanbevolen protocollen strikt worden gevolgd. Bewaar de cellijnen in een vriezer van -80 °C. Gebruik de cellijnen die zijn <20 passages van dooi voor alle experimenten. 3. Opzetten van hardware- en softwareomgeving Hardware-omgeving instellen van het experiment Sluit de confocale controller en de omgekeerde microscoop aan op de computer (zie de tabel met materialen). Installeer het softwareplatform (Tabel met materialen). Schakel de confocale controller en de omgekeerde microscoop in. Start vervolgens Elements. Open de bedieningspanelen van de confocale, laser- en omgekeerde microscoop in Elements. Controleer vervolgens of de drie panelen goed functioneren door de beweging van de gemotoriseerde fase, het schakelen van de microscoopobjectieven en het ruimtelijk scannen van de laserlijnen te testen. Software omgeving setup van AMFIP Installeer IntelliJ, Java Development Kit 14.0, μManager versie 2.0 gamma en Fiji ImageJ op de computer. Open het AMFIP-project dat is gedownload van GitHub (link: https://github.com/njheadshotz/AMFIP) in IntelliJ. Klik op Instellingen | Compiler | Annotatieprocessors en schakel Annotatieverwerking inschakelen in. Klik op Projectstructuur | Artefacten en maak een JAR-bestand. Stel de uitvoermap in op mmplugins onder de map μManager . Klik op Projectstructuur | Bibliotheken en voeg mmplugins en plug-ins toe onder de μManager-directory . Klik op Configuratie toevoegen onder het vervolgkeuzemenu Uitvoeren en maak een toepassing. Enter ij. AfbeeldingJ in de klasse Main. Voer de optie -Xmx3000m -Dforce.annotation.index=true in vm in. Stel de map μManager in op de map Work. Klik op Uitvoeren om μManager te activeren met de AMFIP plugin. Verbind μManager met de omgekeerde microscoop. Voeg de adaptieve driver van de omgekeerde microscoop21 toe aan de map μManager . Open μManager. Klik op Apparaten | Wizard Hardwareconfiguratie en maak een nieuwe configuratie. Voeg het Ti2-stuurprogramma toe onder Beschikbare apparaten. Selecteer alle randapparaten en sla het nieuwe configuratiebestand op. Start μManager opnieuw en selecteer het configuratiebestand in stap 3.2.4 in Micro-Manager Opstartconfiguratie. 4. Gelpreparaat Behandel de glazen afdekplaat gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur (24 °C) met 3-aminopropyltrymethoxysilaan. Gebruik gedeïoniseerd (DI) water om de glazen afdekplaat te spoelen en droog de afdekplaat gedurende 20 minuten op 160 °C. Behandel de glazen afdekplaat gedurende 30 minuten met 0,5% glutaaraldehyde en spoel af met DI-water. Meng acrylamideoplossing, N,N′-methyleenbisacrylamide (bis)-oplossing en fluorescerende kralen gesuspendeerd in 10 mM HEPES-gebufferde zoutoplossing. Gebruik 10% (w/v) ammoniumpersulfaatoplossing en N,N,N′,N′-tetramethylethyleendiamine (TEMED) als initiators van polymerisatie. Wijzig het percentage van elk bestanddeel om de gewenste mechanische stijfheid van polyacrylamide (PAA) hydrogels te bereiken volgens de eerder beschreven protocollen13,14.OPMERKING: In dit protocol, 2 kPa gel: acrylamide = 12,5% en bis-acrylamide = 6,5%; 5 kPa gel: acrylamide = 12,5% en bis-acrylamide = 21,5%; en 40 kPa gel: acrylamide = 12,5% en bis-acrylamide = 31,5%. Alle vermelde % zijn volumepercentages. Na 35 minuten pelt u de glazen afdekkingslip van de gestolde PAA-hydrogel en wast u de hydrogel tweemaal (telkens 5 minuten) met 50 mM HEPES-gebufferde zoutoplossing. Behandel het hydrogeloppervlak gedurende 6 uur met een hydrazine-hydrahydraatoplossing. Spoel de hydrogel af met azijnzuur gedurende 30 min. Verwijder het azijnzuur en spoel af met PBS gedurende 30 minuten. Oxideer de fibronectine-oplossing (50 μg/ml in PBS) met natriumperiode gedurende 30 minuten. Bestrijk het hydrogeloppervlak met de geoxideerde fibronectine-oplossing en wacht 35 minuten. Voeg PBS toe om de hydrogel onder te dompelen en bewaar bij 4 °C. Bedek alle petrischalen die de hydrogels bevatten met aluminiumfolie om blootstelling aan licht aan de hydrogels te voorkomen. 5. Celkweek OPMERKING: Voer celkweek uit met behulp van aseptische techniek. Bevestig de glazen afdekplaten met de PAA-hydrogels aan de 35 mm petrischaal met glazen bodem om fysieke drift van gels tijdens de celzaai- en beeldvormingsprocessen te voorkomen. Til met behulp van een gesteriliseerd schoon pincet de afdekplaat (met de PAA-hydrogel erop) op uit de petrischaal met de bereide gels. Gebruik een droog doekje om waterdruppels op het onderste oppervlak van de glazen afdekplaat op te ruimen. Gebruik het gesteriliseerde pincet om de glazen afdekplaat vast te houden. Plaats kleine druppeltjes (1-5 μL) cyanoacrylaatlijm op de twee diagonale hoeken op het onderste oppervlak. Gebruik gesteriliseerde doekjes om overtollige lijm te verwijderen. Gebruik het gesteriliseerde pincet om de afdekplaat in de petrischaal met glazen bodem te vervangen. Druk lichtjes op de hoeken van de afdekplaat om ervoor te zorgen dat de lijmdruppels volledig contact maken met het oppervlak van de petrischaal. Plaats het deksel terug op de petrischaal om de verdamping van PBS in de PAA-hydrogels te minimaliseren. Wacht 3 minuten om de lijm te laten stollen en drogen in de petrischaal. Vul de petrischaal met 4 ml PBS. Herhaal de bovenstaande stappen 5.1.1-5.1.8 voor de resterende PAA-hydrogelmonsters in de petrischalen die voor beeldvorming worden gebruikt. Gebruik 75% ethanol om het buitenoppervlak van alle petrischalen te steriliseren en over te brengen naar de bioveiligheidskast voor weefselkweek. Zet het ultraviolette licht gedurende 5 minuten aan en steriliseer de monsters. Zaai de cellen op het bovenste oppervlak van de gel. Schakel het ultraviolette licht uit. Haal de kolf (met B2B/PC9-cellen) uit de incubator van 37 °C in de bioveiligheidskast. Gebruik een pipet die is aangesloten op een vacuümpomp om al het kweekmedium op te zuigen en voeg 5 ml PBS toe om de kolf te wassen. Voeg 2 ml 0,05% trypsine toe om de cellen los te maken van de bodem van de kolf. Plaats de kolf in de couveuse. Wacht 5 minuten. Breng de kolf over in de bioveiligheidskast. Voeg 8 ml vers kweekmedium toe aan de kolf en pipetteer meerdere keren op en neer om de cellen homogeen te laten zweven. Breng alle 10 ml van de celsuspensie over in een buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 × g . Controleer de celkorrel aan de onderkant van de buis. Kantel de buis langzaam horizontaal en gebruik de aanzuigende pipet om al het kweekmedium uit de buis te verwijderen zonder de celkorrel aan te raken. Voeg vervolgens 8 ml vers kweekmedium toe en pipetteer meerdere keren op en neer totdat alle cellen homogeen met het medium zijn gemengd. Deponeer 100 μL van de celsuspensie (150 cellen/μL) op het geloppervlak en wacht 5 minuten. Voeg vervolgens langzaam 4 ml vers kweekmedium toe aan de petrischalen; vermijd het toevoegen van het verse medium direct aan de gel. Plaats de petrischaal in de incubator van 37 °C. Wacht om de cellen aan het geloppervlak te laten hechten (B2B: 0,5-1 uur; PC9: 4-5 uur). 6. Beeldvorming van cellen OPMERKING: AMFIP maakt automatische, meerkanaals- en langetermijnbeeldvorming mogelijk door te coördineren met verschillende hardware- en softwaresystemen: (1) AMFIP manipuleert μManager om automatisch het gemotoriseerde podium van de Ti2-E-microscoop naar meerdere gezichtsvelden (FOV’s) te verplaatsen en heldere veldbeelden te verkrijgen via een monochrome camera (Table of Materials); en (2) AMFIP activeert meerdere macrobestanden in Elements met een aangepast Java-script om automatische bewerkingen uit te voeren voor confocale z-stack imaging en het schakelen van verschillende laserkanalen (405 nm en 488 nm). Stel de omgeving in voor langetermijnbeeldvorming. Plaats de omgevingskamer op het gemotoriseerde stadium van de omgekeerde microscoop. Stel het CO2-debiet in op 160 ml/min en pas de temperatuur van de kamer aan (boven: 44 °C; bad: 42 °C; fase: 40 °C). Voeg vervolgens 40 ml gezuiverd water toe aan het bad van de kamer. Haal de petrischaal met glazen bodem met cellen uit de couveuse eruit en plaats deze in de omgevingskamer. Schakel de confocale controller en de omgekeerde microscoop in. Schakel het lichtpad naar rechts en observeer de cellen die zich hechten met μManager. Als er voldoende cellen aan de gel zijn gehecht, breng de petrischaal terug naar de couveuse. Als er niet genoeg cellen aan de gel zijn gehecht, ga dan door met de celincubatie gedurende nog eens 30 minuten voor B2B en 60 minuten voor PC9-cellen. Knip twee kleine stukjes plakband en plak ze op de kamer rond het ronde gat. Breng vervolgens een beetje lijm aan op de tape (alleen op het gebied dat de petrischaal zal bedekken). Haal de petrischaal uit de couveuse. Plaats vervolgens langzaam de petrischaal in de kamer en laat de bodem van de schaal contact maken met de lijm. Druk 1 minuut op het deksel van de petrischaal om de lijm volledig contact te laten maken met de petrischaal en te laten stollen. Duw vervolgens de petrischaal voorzichtig horizontaal om te bevestigen dat de petrischaal onbeweeglijk is in de kamer. Sluit het deksel van de kamer. Stel de beeldacquisitieparameters in voor bright-field imaging. Open IntelliJ en stel een parameter T1 (bijvoorbeeld 120 s) in regel 93 van het bestand in Elements_script.java. Zorg ervoor dat deze waarde groter is dan de looptijd van de macro in Elementen die worden gebruikt voor de confocale weergave van één gezichtsveld (FOV). Klik op de knop Uitvoeren om het AMFIP IntelliJ-project te starten. Klik op de knop Live en Multi-D Acq. op de hoofdinterface van μManager. Schakel vervolgens het lichtpad van de omgekeerde microscoop naar rechts voor bright-field imaging, schakel over naar het 10x objectief en open het light-emitting diode (LED) licht (de lichtbron voor bright-field imaging; intensiteit: 5%). Klik op het lichtpad, het microscoopobjectief en de LED-lampknop in het Elements Ti2-paneel of druk handmatig op de bijbehorende knoppen op de microscoop. Pas de XY-joystick en de knop van het Z-vlak aan om de juiste positie en het scherpstelvlak van de gel op de petrischaal te vinden. Gebruik een 10x-objectief om de juiste FOV’s te vinden van meerdere afzonderlijke cellen die aan de gel zijn bevestigd. Schakel het selectievakje Meerdere posities (XY) in het venster Multidimensionale acquisitie in. Klik op de knop Positielijst bewerken… en observeer het venster Lijst met werkgebiedposities dat verschijnt. Wijzig vervolgens het doel in 40x, verhoog de intensiteit van het LED-licht tot 15%, pas de XY-gemotoriseerde fase opnieuw aan om de FOV’s te lokaliseren en noteer de coördinaten door op de knop Markeren in het venster Lijst met podiumposities te klikken. Record 67 gewenste FOV’s. Klik op de knop Opslaan als… in het venster Lijst met werkgebiedposities om de coördinaten vast te leggen. Voer T1 (de parameter, bijvoorbeeld 120 s, gedefinieerd in stap 6.2.1) in het tijdsinterval van beeldacquisitie in op T1 in de sectie Tijdpunten in het venster Multidimensionale acquisitie . Stel de beeldacquisitie in voor 2D-YAP- en kraalafbeeldingen. Open Elements, wijzig het lichtpad naar rechts voor confocale beeldvorming en schakel het LED-lampje uit. Klik vervolgens op de knop Interlock verwijderen en schakel het FITC-laserkanaal in (voor YAP-beeldvorming) door het vakje FITC aan te vinken. Pas de scansnelheid aan op 1 frame per 2 s door op de 1/2 knop te klikken en aan de knop van het Z-vlak te draaien om snel de Z-positie van de aangesloten cellen te vinden. Noteer de onder- en bovengrenzen voor de Z-stack. Klik op Macro op het bovenste lint, selecteer Macro-editor onder het vervolgkeuzemenu Macro en voer de waarden uit stap 6.3.2 in een macrobestand in. Schakel het 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) laserkanaal (voor het afbeelden van kralen) in door het DAPI-vakje aan te vinken om de gerichte Z-positie van kralen te vinden en vast te leggen. Ga naar macro-editor en voer de opgenomen waarden in het macrobestand in. Stel de taak in om het gemotoriseerde podium te verplaatsen met AMFIP. Ga naar μManager en klik op Plugins | Automatisering om de grafische gebruikersinterface (GUI) van AMFIP te openen. Klik op de knoppen Punt toevoegen of Punt verwijderen om het exacte aantal geselecteerde FOV’s te verkrijgen. Voer de geregistreerde coördinaten van FOV’s in het coördinatenpaneel in. Definieer de totale experimenttijd in het tekstveld Totale experimenttijd . Klik op de knop Extra tijdconfiguratie en definieer het tijdsinterval T2 (bijv. 30 min) van het verplaatsen van de gemotoriseerde fase naar elke FOV. Maximaliseer de venstergrootte van Elements en sleep de GUI van AMFIP naar de rechterkant van het scherm om te voorkomen dat de GUI de automatische bewerkingen van de cursor verstoort. Klik op de knop Enter . Nadat de eerste macro is voltooid, klikt u op de knop Verwerven! in het venster Multidimensionale acquisitie . Los de cellen op na de beeldverwerving. Nadat u de langetermijnbeeldvorming hebt voltooid, stopt u de AMFIP-taak door op de knop Pauzeren in het venster van de automatiseringsplug-in en op de knop Stoppen in het venster Multidimensionale acquisitie te klikken. Open Elements en stel Z-stack imaging in door op de knoppen Boven en Onder in het ND Acquisition-venster te klikken (stel het Z-bereik in op groter dan het Z-bereik van de kralen). Schakel het lichtpad naar rechts en open het LED-licht (intensiteit: 15%). Verwijder langzaam en voorzichtig de deksels van de kamer en de petrischaal. Bewaak ondertussen het heldere veldbeeld op eventuele afwijkingen van de FOV. Gebruik een plastic pipet om 0,5 ml natriumdodecylodeylsulfaat (SDS) -oplossing op te nemen, houd de plastic pipet voorzichtig iets boven het kweekmedium in de petrischaal en voeg 1-2 druppels van de SDS-oplossing toe aan het kweekmedium. Zodra de cellen in de heldere veldweergave zijn opgelost, schakelt u het lichtpad naar links, sluit u het LED-lampje en klikt u op de knop Interlock verwijderen . Voer de Z-stack imaging uit. Sla de afbeeldingsstapel op en geef deze een naam als Reference_N (N is het volgnummer van elke FOV). Klik op de knop Meerdere posities (XY) in het venster Multidimensionale acquisitie . Selecteer vervolgens de volgende FOV en klik op de knop Ga naar om de gemotoriseerde fase naar de tweede FOV te verplaatsen. Herhaal stap 6.5.7 voor elke FOV. 7. Meting van de YAP N/C ratio Voer beeldanalyse uit om de YAP N/C-verhouding te meten met behulp van de Fiji ImageJ-software (figuur 4). Open Fiji ImageJ. Importeer de bright-field image stack voor alle FOV’s die door μManager zijn verkregen. Open het vervolgkeuzemenu Afbeelding en selecteer Stapels | Gereedschap | Slice Keeper. Exporteer vervolgens de afbeeldingsstapel met heldere velden voor elke FOV. Importeer de fluorescentieafbeelding van het FITC-kanaal en leg deze over elkaar heen met de afbeelding met het heldere veld voor dezelfde FOV. Kies hiervoor de fluorescerende afbeelding en selecteer Overlay | Afbeelding toevoegen… (Afbeelding toe te voegen: het bright-field beeld; X- en Y-locatie is afhankelijk van de grootte van het heldere veldbeeld dat door verschillende camera’s wordt verkregen; Ondoorzichtigheid: 60-70). Open het vervolgkeuzemenu Analyseren en selecteer Metingen instellen…. Selecteer Gebied; Geïntegreerde dichtheid en gemiddelde grijswaarde. Klik op de knop Freehand-selecties op de hoofdinterface van ImageJ. Teken de omtrek van het cellichaam en de gewenste kern. Klik vervolgens op | analyseren Meet of druk op de M-knop op het toetsenbord. Bekijk het venster Resultaten dat verschijnt. De waarden onder de kolom Gebied vertegenwoordigen de oppervlakte van het geselecteerde gebied (μm2) en de waarden onder de kolom IntDen vertegenwoordigen de fluorescentie-intensiteit van het geselecteerde gebied. Bereken de YAP N/C-verhouding met behulp van de volgende formules (1), (2) en (3): (1) (2) (3)Waar Inuc en Icel de relatieve intensiteit van de kern en het cellichaam vertegenwoordigen, en Anuc en Acel het gebied van de kern en het cellichaam. R is de YAP N/C ratio. Sla de contouren op voor toekomstige berekening van dipooltractiekracht en peri-cel / peri-nucleaire verplaatsing. Klik hiervoor op | analyseren Gereedschap | XY-coördinaten opslaan… 8. Meting van het tractieveld Pas tractiekrachtmicroscopie toe via Fiji ImageJ-plug-ins22,23. Open Fiji ImageJ. Importeer de afbeeldingsstapel van kralen voor een FOV. Selecteer het segment met de duidelijkste verdeling van kralen en pak het uit door op Afbeeldingen | Stapels | Gereedschap | Slice Keeper. Importeer de afbeeldingsstapel van de referentie voor dezelfde FOV. Kies het segment met dezelfde helderheid en hetzelfde contrast als het segment in stap 8.1.3. Pak het vervolgens uit als referentieafbeelding. Selecteer Afbeeldingen | Stapels | Gereedschap | Voeg samen om de twee segmenten uit stap 8.1.3 en 8.1.5 te combineren (selecteer de referentieafbeelding als eerste segment). Selecteer Plugins | Template Matching | Segmenten uitlijnen in stack- of plug-ins | Image Stabilizer om de twee segmenten uit te lijnen. Selecteer Afbeelding | Stapels | Stapelen op afbeeldingen. Selecteer vervolgens Afbeelding | | opzoektabellen Groen om de kleur van het eerste segment om te zetten in groen en selecteer Afbeelding | | opzoektabellen Rood om de kleur van het tweede segment om te zetten in rood. Selecteer Afbeelding | Kleur | Kanalen samenvoegen om de twee afbeeldingen samen te voegen. Overlap de afbeelding met de afbeelding met een helder veld van dezelfde FOV en gebruik deze overlappende afbeelding om parelverplaatsing te observeren. Selecteer Plugins | PIV | iteratieve PIV (Basic)…. Stel de grootte van het ondervragingsvenster in op 128/256; 64/128; 32/64 (minstens vier kralen per verhoorvenster). Stel de correlatiedrempel in op 0,6. Klik op OK. Nadat de berekening is voltooid, slaat u het tekstbestand met de onbewerkte gegevens van kralenverplaatsing op in een gewone map die door de gebruiker is gemaakt. Selecteer Plugins | FTTC | FTTC en kies het tekstbestand in stap 8.1.9. Voer de pixelgrootte (μm), de modulus van de gel van de Young (Pascal) en de plotbreedte en -hoogte in op basis van het experiment en het beeld van kralen. Klik op OK om het tekstbestand met de onbewerkte gegevens van de tractiekracht automatisch op te slaan in dezelfde map als het tekstbestand in stap 8.1.12. Gebruik grafische software (Table of Materials) om het tractieveld met dezelfde schaal voor meerdere cellen uit te zetten (figuur 1B, C en figuur 2B, C). Voeg het tekstbestand met de onbewerkte tractiegegevens in een spreadsheet in. Maak een nieuw blad, voer de Y-coördinaten van tractie in de eerste rij in (rangschik van hoge waarden naar lage waarden) en de X-coördinaten in de eerste kolom (rangschik van laag naar hoog). Voer de waarde van tractie in voor elke coördinaat uit de onbewerkte gegevens. Sla het werkblad in stap 8.2.2 op als een *.csv bestand. Open Origin. Klik op Bestand | Open en importeer het *.csv bestand in stap 8.2.4. Selecteer alle cellen en klik op Plot | Contour| Contour – Kleurvulling. Selecteer in het venster Plotten: plotvm de optie Y in de kolommen om de Y-waarden automatisch in te stellen op de eerste rij en X-waarden in de eerste kolom. Geef vervolgens de titel een naam en klik op OK. Dubbelklik in het grafiekvenster dat verschijnt op de heatmap. Klik op Niveaus in het venster Colormap/Contours . Wijzig vervolgens het schaalniveau in een redelijk bereik (0300 in deze analyse) en klik op OK. Klik op Regels, verwijder het vinkje bij Alleen weergeven op hoofdniveaus en vink Alles verbergen aan. Klik vervolgens op OK. Klik met de rechtermuisknop op de grafiek en selecteer Grafieken exporteren…. Sla de afbeelding op in het opgegeven pad. Gebruik MATLAB om de dipoolceltractie te berekenen. Sla het tekstbestand met onbewerkte traction-gegevens (uit stap 8.1.12) en het ROI-coördinatenbestand (Cel Boundary Region of Interest) (uit stap 7.1.9) op in dezelfde map die is gedefinieerd in stap 8.1.12. Breng alle MATLAB-bestanden die zich in het AMFIP-pakket bevinden over naar deze map. Open MATLAB. Open de map die is gedefinieerd in stap 8.1.12 en open het dipooltractieberekeningsfunctiebestand absdipole.m in stap 8.3.1 naar deze map is overgebracht. Lees de twee tekst-/csv-bestanden in stap 8.3.1 in de MATLAB-werkruimte en wijs een matrix toe aan twee variabelen (bijv. Tractie en roi). Voer de functie absdiple (tractie, roi) uit.OPMERKING: De eerste kolom van de uitgang is de dipooltractiekracht in nN (nano-Newton). De tweede kolom van de uitgang is de hoek van de dipooltractiekracht ten opzichte van de horizontale as.

Representative Results

Duidelijke YAP-verdeling en -dynamiek in CRISPR/Cas9-engineered PC9-kanker en B2B normale cellen tijdens celverspreidingRepresentatieve fluorescentiebeelden van YAP-verdeling in enkele B2B- en PC9-cellen op 2, 5, 40 kPa PAA-gels en glazen coverslip zijn weergegeven in figuur 1A en figuur 2A. De nucleaire lokalisatie van YAP in B2B-cellen nam toe met toenemende substraatstijfheid (figuur 1A), terwijl PC9-cellen een vergelijkbare YAP-concentratie vertoonden in de kern en het cytoplasma op substraten met verschillende stijfheid (figuur 2A). Representatieve fluorescentiebeelden van YAP-verdeling in enkelvoudige, zich verspreidende B2B- en PC9-cellen op het 5 kPa hydrogelsubstraat (van de 0e h tot de 10e h na de cellen die aan de substraten zijn bevestigd) worden weergegeven in respectievelijk figuur 1B en figuur 2B. De B2B-cel verhoogde monotoon het verspreidingsgebied in de loop van de tijd, samen met een afname van de YAP N / C-verhouding (figuur 1B), terwijl de PC9-cel een relatief onveranderlijk celspreidingsgebied, oriëntatie en YAP N / C-verhouding handhaafde gedurende het 10 h-verspreidingsproces (figuur 2B). Tijdens de 10 uur durende vroege verspreiding vervormde de representatieve B2B-cel constitutief het substraatoppervlak en paste tijd-evoluerende celtractie toe over het hele celgebied (figuur 1C en figuur 1D). Daarentegen ontwikkelde de representatieve PC9-cel alleen verplaatsing en tractie aan de twee uiteinden van het cellichaam en nam de tractie na 7,5 uur af (figuur 2C en figuur 2D). Meer time-lapse beelden en tractiemetingen van B2B- en PC9-cellen in het vroege verspreidingsstadium zijn te vinden in Supplemental Figure S2 en Supplemental Figure S3. Andere modi van PC9-celdynamica werden ook waargenomen (figuur 6). Parallel aan deze verschillende verspreidingskenmerken vertoonden B2B- en PC9-cellen een duidelijke YAP-verdeling en -dynamiek (figuur 3). Op een 5 kPa-gel werd YAP in B2B-cellen geconcentreerd in de kern op de 0e h en werd homogener verdeeld over het cellichaam op de 10e h. PC9-cellen vertoonden echter een meer homogene verdeling van YAP in de kern en het cytoplasma gedurende de gehele 10 uur van het verspreidingsproces. Om de YAP-activiteit en translocatie in B2B- en PC9-cellen kwantitatief te analyseren, werd de YAP N / C-verhouding berekend met behulp van het algoritme beschreven in figuur 4. Om de verschillende YAP-dynamica verder te onderzoeken, werden temporele veranderingen in YAP N / C-verhouding, cel / kerngebied en tractie van meerdere enkele B2B-cellen (n = 10) en PC9-cellen (n = 5) vergeleken (figuur 5). Het bleek dat de gemiddelde YAP N/C-verhouding van B2B-cellen daalde van 2,54 ± 0,22 tot 1,79 ± 0,21 (n = 10; p = 0,0022**; Figuur 5A), terwijl de gemiddelde YAP N/C-verhouding van PC9-cellen veranderde van 1,92 ± 0,26 naar 1,57 ± 0,07 (n = 5; p = 0,187 (niet significant (ns)); Figuur 5A). De gemiddelde dipooltractie van B2B-cellen veranderde van 256,17 ± 123,69 nN naar 287,44 ± 99,79 nN (p = 0,7593 (ns); Figuur 5B). De gemiddelde dipooltractie van PC9-cellen veranderde van 141,19 ± 33,62 nN naar 168,52 ± 73,01 nN (p = 0,7137 (ns); Figuur 5B). Het gemiddelde celspreidingsgebied van B2B-cellen steeg van 613,89 ± 102,43 μm2 tot 942,51 ± 226,71 μm2 (p = 0,0512 (ns); Figuur 5C). Het gemiddelde celspreidingsgebied van PC9-cellen veranderde van 495,78 ± 97,04 μm2 naar 563,95 ± 89,92 μm2 (p = 0,5804 (ns); Figuur 5C). Het gemiddelde nucleus spread gebied van B2B cellen steeg van 181,55 ± 36,18 μm2 tot 239,38 ± 43,12 μm2 (p = 0,1217 (ns); Figuur 5D) en het gemiddelde kernspreidingsgebied van PC9-cellen veranderde van 133,31 ± 30,05 μm2 naar 151,93 ± 22,49 μm2 (p = 0,5944 (ns); Figuur 5D). Deze resultaten suggereren dat (1) B2B-cellen een constitutief substraat-stijfheidsafhankelijke YAP N/C-verhouding vertonen; (2) de tractie van B2B-cellen is hoger dan die van PC9-cellen; en (3) in tegenstelling tot B2B-cellen vertonen PC9-cellen een beperkte toename van het celoppervlak en veranderingen in de YAP N / C-verhouding tijdens het 10 uur durende verspreidingsproces. Correlatie van YAP-verdeling en -dynamiek met de migratiestatussen van B2B-cellenYAP N/C ratio en dipooltractie van alle B2B (n=10) en PC9 (n=5) cellen als functie van celspreidingsgebied en nucleus spread gebied werden vergeleken. De YAP N/C-verhouding en dipooltractie van PC9-cellen correleerden niet duidelijk met hun kleine cel- en kernspreidingsgebiedbereiken (figuur 6). Daarentegen leken de YAP N/C-verhouding en dipooltractie van B2B-cellen twee verschillende trends te volgen (figuur 6A en figuur 6C), wat suggereert dat er mogelijk twee groepen B2B-cellen naast elkaar bestaan in dit experiment. In de eerste groep nemen de YAP N/C-verhouding en de dipooltractie toe samen met de vergroting van het celverspreidingsgebied en bereiken ze hun maxima bij ~ 1000 μm2 (figuur 6C en figuur 6D, aangegeven door de gele stippellijn). In de tweede groep nemen de YAP N/C-verhouding en de dipooltractie langzamer toe met de vergroting van het celverspreidingsgebied en handhaven ze bijna constante waarden wanneer het celspreidingsgebied blijft toenemen (figuur 6C,D, aangegeven door de groene stippellijn). PC9-kankercellen genereren tractie in peri-nucleaire regio’sEnkele, zich verspreidende PC9-cellen verdringen de substraten in de peri-nucleaire gebieden, beginnend vanaf de 6e h van de cultuur (figuur 7C). Om de peri-nucleaire verplaatsing veroorzaakt door celtractie te visualiseren, overlapten we de beelden van fluorescerende kralen genomen vóór (rood) en na (groen) de verwijdering van de cellen uit de substraten (zie het protocolgedeelte voor details). De kralen die geen verplaatsing hebben, zien er geel uit in de overlappende afbeeldingen, d.w.z. de toevoeging van rode en groene kleuren. Daarentegen zullen de kralen die door celtractie uit hun rustposities worden verplaatst, gescheiden groene en rode kleuren vertonen. Met name in zowel PC9(figuur 7C,D)- als B2B-cellen (figuur 7E) werd parelverplaatsing waargenomen in het cytoplasma en in de kern, naast die aan de celgrens. Om de peri-nucleaire verplaatsing te benadrukken, wordt de Boussinesq-vergelijking uit de lineair-elasticiteitstheorie gebruikt om de 2D-theoretische verplaatsing te voorspellen die wordt gegenereerd door een hypothetische dipoolkracht op de celgrens (zwarte stippellijn in figuur 7B)24. Door deze theoretische curve te vergelijken met de reële substraatverplaatsing gemeten langs dezelfde as (witte stippellijn in figuur 7D), bleken de werkelijke verplaatsingen binnen de kern 1,5-8-voudig groter te zijn dan de theoretische waarde (figuur 7B), wat wijst op het bestaan van tractiekracht in de peri-nucleaire gebieden. Figuur 1: Veranderingen in YAP-expressie/-verdeling, substraatverplaatsingsveld en tractieveld van een B2B-normale cel op substraten met verschillende stijfheid en tijdens vroege verspreiding. (A) De YAP-expressie van een B2B-cel gezaaid op 2, 5 en 40 kPa PAA-gels en een glazen dekzeil na 60 uur van de eerste cel-substraataanhechting. (B) De B2B-cel werd gezaaid op een 5 kPa PAA-gel en gedurende 10 uur na de eerste cel-substraataanhechting afgebeeld. YAP-expressie wordt weergegeven door groene fluorescentie-intensiteit. Opmerking: De YAP-intensiteit in de kern neemt geleidelijk af, maar blijft na verloop van tijd hoger dan die in het cytoplasma. De kleurenbalken geven de niveaus van YAP-expressie aan (groen = hoge expressie; zwart = lage expressie) in (A) en (B). (C) Substraatvervorming (overlapt met het heldere veldbeeld) op cellocatie wordt weergegeven door het verplaatsingsveld op elk tijdstip. Verplaatsingsrichting en -grootte worden weergegeven door respectievelijk de pijlrichting en kleur. De verplaatsing wordt groter aan de uiteinden van het B2B-cellichaam naarmate het celverspreidingsgebied toeneemt. De kleurenbalk geeft de verplaatsingsmagnitude aan (karmozijnrood = hoge magnitude; zwart = lage magnitude). (D) Tractieveld (overlapt met het heldere veldbeeld) berekend op basis van het verplaatsingsveld. De tractie is geconcentreerd op de grens van de B2B-cellen. De witte en gele stippellijnen bakenen de grenzen van respectievelijk de cel en de kern af. De kleurenbalk geeft de tractiemagnitude aan (karmozijnrood = hoge magnitude; zwart = lage magnitude). Schaalbalken = 20 μm. Afkortingen: YAP = Yes-associated protein; PAA = polyacrylamide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Veranderingen in YAP-expressie/-verdeling, substraatverplaatsingsveld en tractieveld van een PC9-kankercel op substraten met verschillende stijfheid en tijdens vroege verspreiding. (A) De YAP-expressie van een PC9-cel gezaaid op 2, 5 en 40 kPa PAA-gels en glazen deklap na 65 uur na de eerste celsubstraataanhechting. (B) De PC9-cel werd gezaaid op een 5 kPa PAA-gel en gedurende 10 uur na de eerste cel-substraataanhechting afgebeeld. YAP-expressie wordt weergegeven door groene fluorescentie-intensiteit. Opmerking: De YAP-intensiteit plateaus vanaf 1,5 uur. De kleurenbalken geven de niveaus van YAP-expressie aan (groen = hoge expressie; zwart = lage expressie) in (A) en (B). (C) Substraatvervorming (overlapt met het heldere veldbeeld) op cellocatie wordt weergegeven door fluorescerend parelverplaatsingsveld op elk tijdstip. Verplaatsingsrichting en -grootte worden weergegeven door respectievelijk de pijlrichting en kleur. Het verplaatsingsveld veroorzaakt door PC9-cellen is kleiner dan dat veroorzaakt door de B2B-cel. Gedurende het 10 uur durende verspreidingsproces blijft het gebied van PC9-cellen bijna constant. De kleurenbalk geeft de verplaatsingsmagnitude aan (karmozijnrood = hoge magnitude; zwart = lage magnitude). (D) Tractieveld (overlapt met het heldere veldbeeld) berekend op basis van verplaatsingsveld. De tractie die door deze representatieve PC9-cel wordt gegenereerd, neemt geleidelijk af van de 6e h tot de 10e h. De witte en gele stippellijnen bakenen de grenzen van respectievelijk de cel en de kern af. De kleurenbalk geeft de tractiemagnitude aan (karmozijnrood = hoge magnitude; zwart = lage magnitude). Schaalbalken = 20 μm. Afkortingen: YAP = Yes-associated protein; PAA = polyacrylamide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: YAP-verdeling in B2B- en PC9-cellen in het vroege verspreidingsstadium. (A) YAP-intensiteit van de B2B-cel wordt gemeten langs de toegewezen rode as op de 0e en de 10e h. (B) Bij de 0e h vertoont de YAP-intensiteit dramatische concentratieverschillen tussen de kern en het cytoplasma. Bij de 10e h wordt de YAP-intensiteit homogener over het hele cellichaam. (C) YAP-intensiteit van de PC9-cel wordt gemeten langs de toegewezen blauwe as op de 0e en de 10e h. (D) Op de 0e h lijkt de YAP-intensiteit in de kern hoger dan die in het cytoplasma, hoewel het verschil niet zo opmerkelijk is als dat in B2B-cellen. Bij de 10e h lijkt de YAP-intensiteit in de kern nog steeds iets hoger dan die in het cytoplasma, met een variatietrend vergelijkbaar met die bij de 0e h. Schaalbalken = 20 μm (A, C). Afkorting: YAP = Ja-geassocieerd eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Meten van de YAP N/C ratio. (1) Pas Fiji ImageJ toe om de omtrek van de kern te tekenen en het 2D-geprojecteerde gebied Anuc te meten. (2) Meet de fluorescentie-intensiteit in de kern Inuc. (3) Teken de omtrek van het cellichaam en meet het geprojecteerde gebied Acel. (4) Meet de fluorescentie-intensiteit in de cel Icel. (5) Bereken de YAP-kerndichtheid Dnuc, YAP-cytoplasmadichtheid Dcyto en hun verhouding R: Dnuc = Inuc / Anuc; Dcyto=(Icel-Inuc)/(Acel-Anuc); R=Dnuc/Dcyto. De kleurenbalk geeft de niveaus van YAP-expressie aan (groen = hoge expressie; zwart = lage expressie). Schaalbalk = 20 μm. Afkortingen: YAP = Yes-associated protein; N = kern; C = cytoplasma. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Duidelijke YAP-expressie, cel/kernmorfologie en cellulaire tractie in PC9-kanker en B2B normale cellen tijdens celverspreiding. (A) YAP N/C-verhoudingsverandering gedurende de eerste 10 uur van de verspreiding van eencellige cellen. De gemiddelde YAP N/C-verhouding van B2B-cellen (rode kolom; n = 10) veranderde van 2,54 ± 0,22 naar 1,79 ± 0,21 (n = 10; p = 0,0022**), terwijl de gemiddelde YAP N/C-verhouding van PC9-cellen (blauwe kolom; n = 5) veranderde van 1,92 ± 0,26 naar 1,57 ± 0,07 (p = 0,187 (ns)). (B) De gemiddelde dipooltractie als functie van de tijd. De gemiddelde dipooltractie van B2B-cellen veranderde van 256,17 ± 123,69 nN naar 287,44 ± 99,79 nN (p = 0,7593 (ns)) en de gemiddelde dipooltractie van PC9-cellen veranderde van 141,19 ± 33,62 nN naar 168,52 ± 73,01 nN (p = 0,7137 (ns)). (C) Het gemiddelde celoppervlak als functie van de tijd. Het gemiddelde celspreidingsgebied van B2B-cellen steeg van 613,89 ± 102,43 μm2 tot 942,51 ± 226,71 μm2 (p = 0,0512 (ns)) en het gemiddelde celspreidingsgebied van PC9-cellen veranderde van 495,78 ± 97,04 μm2 naar 563,95 ± 89,92 μm2 (p = 0,5804 (ns)). (D) Het gemiddelde kernoppervlak als functie van de tijd. Het gemiddelde nucleus spread gebied van B2B cellen steeg van 181,55 ± 36,18 μm2 tot 239,38 ± 43,12 μm2 (p = 0,1217 (ns)) en het gemiddelde nucleus spread gebied van PC9 cellen veranderde van 133,31 ± 30,05 μm2 naar 151,93 ± 22,49 μm2 (p = 0,5944 (ns)). Afkortingen: YAP = Yes-associated protein; N = kern; C = cytoplasma; ns = niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: YAP N/C-verhouding en dipooltractiekracht als functie van het verspreidingsgebied van cel en kern. YAP N/C-verhouding en dipooltractie van B2B-cellen (n=10) en PC9-cellen (n=5) worden berekend van de 6e h tot de 10e h na hechting aan substraat. (A) YAP N/C-verhouding als functie van het celverspreidingsgebied. De YAP N/C-verhoudingen van B2B-cellen variëren van 1,16 tot 2,53, terwijl de YAP N/C-verhoudingen van PC9-cellen variëren van 1,27 tot 1,88. Het celspreidingsgebied van B2B-cellen varieert van 391,94 μm2 tot 1986,40 μm2. Het celverspreidingsgebied van PC9-cellen varieert van 284,46 μm2 tot 830,12 μm2. (B) YAP N/C-verhouding als functie van het kernspreidingsgebied. Het kernspreidingsgebied van B2B-cellen varieert van 107,09 μm2 tot 514,28 μm2. Het kernspreidingsgebied van PC9-cellen varieert van 58,03 μm2 tot 259,65 μm2. Dipooltractie van B2B-cellen als functie van het celverspreidingsgebied (C) en het kernverspreidingsgebied (D). Spreidende en niet-migrerende B2B-cellen vertonen een hogere tractie (van 47,50 nN tot 1051,48 nN) met een lager cel- en kerngebied. Tijdens het verspreiden en migreren vertonen B2B-cellen een lagere tractie (van 105,80 nN tot 310,28 nN) met een groter bereik van cel- en kernoppervlak. Afkortingen: YAP = Yes-associated protein; N = kern; C = cytoplasma. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 7: Peri-nucleaire verplaatsing in normale B2B- en kanker-PC9-cellen. (A) Schematisch zijaanzichtdiagram van peri-nucleaire en peri-cel verplaatsing gemeten vanaf kraalverplaatsing in het substraat. (B) Substraatverplaatsing onder de PC9-cel wordt gemeten langs de celas (witte stippellijn in 7D). De theoretische verplaatsing gegenereerd door de dipoolkracht op de celgrens wordt weergegeven door de Boussinesq-vergelijking (zwarte onderbroken kromme). (C) en (D) Overlappende fluorescerende kraalafbeeldingen met (rode) en zonder (groene) cellen voor de PC9-cellen op de 6e h na bevestiging (bovenaanzicht). Gele (exacte overlap van rode en groene kleuren) kralen geven geen verplaatsing aan. De gescheiden groene en rode kralen (puntig door gele pijlen) vertegenwoordigen de peri-nucleaire verplaatsing. Gele pijlen geven deze samengetrokken peri-nucleus vlekken aan de periferie van de kern aan. (E) Peri-nucleaire verplaatsing gegenereerd door de B2B-cel op 1,5e h na cel-substraataanhechting. Schaalbalken = 10 μm (C–E). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Aanvullende figuur S1: De genomische sequentiekaart van YAP-mNeonGreen21-10/11. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullende figuur S2: Veranderingen in YAP-expressie/-verdeling, substraatverplaatsingsveld en tractieveld van B2B-normale cellen tijdens vroege verspreiding. (A, D, G, J, M) De B2B-cel werd gezaaid op een 5 kPa PAA-gel en meer dan 10 uur na de eerste cel-substraataanhechting in beeld gebracht. YAP-expressie wordt weergegeven door groene fluorescentie-intensiteit. Opmerking: De YAP-intensiteit in de kern neemt geleidelijk af, maar blijft na verloop van tijd hoger dan in het cytoplasma. De kleurenbalken geven de niveaus van YAP-expressie aan (groen = hoge expressie; zwart = lage expressie) in (A, D, G, J, M). (B, E, H, K, N) Substraatvervorming (overlapt met het heldere veldbeeld) op cellocatie wordt weergegeven door het verplaatsingsveld op elk tijdstip. Verplaatsingsrichting en -grootte worden weergegeven door respectievelijk de pijlrichting en kleur. De verplaatsing wordt groter aan de periferie van het B2B-cellichaam naarmate het celverspreidingsgebied toeneemt. De kleurenbalken geven de verplaatsingsgrootheid aan (karmozijnrood = hoge magnitude; zwart = lage magnitude) in (B, E, H, K, N). (C, F, I, L, O) Tractieveld (overlapt met het heldere veldbeeld) berekend op basis van het verplaatsingsveld met behulp van traction force microscopie. De tractie is geconcentreerd aan de periferie van B2B-cellen. De kleurenbalken geven tractiemagnitude aan (karmozijnrood = hoge magnitude; zwart = lage magnitude) in (C, F, I, L, O). Schaalbalken = 20 μm. Afkortingen: YAP = Yes-associated protein; PAA = polyacrylamide. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullende figuur S3: Veranderingen in YAP-expressie / -distributie, substraatverplaatsingsveld en tractieveld van PC9-kankercellen tijdens vroege verspreiding. (A, D, G, J) De PC9-cel werd gezaaid op een 5 kPa PAA-gel en meer dan 10 uur na de eerste cel-substraataanhechting afgebeeld. YAP-expressie wordt weergegeven door groene fluorescentie-intensiteit. Opmerking: De YAP-intensiteit in de kern neemt geleidelijk af, maar blijft na verloop van tijd vergelijkbaar met of iets lager dan die in het cytoplasma. De kleurenbalken geven de niveaus van YAP-expressie aan (groen = hoge expressie; zwart = lage expressie) in (A, D, G, J). (B, E, H, K) Substraatvervorming (overlapt met het heldere veldbeeld) op cellocatie wordt weergegeven door het verplaatsingsveld op elk tijdstip. Verplaatsingsrichting en -grootte worden weergegeven door respectievelijk de pijlrichting en kleur. De verplaatsing wordt groter aan de periferie van het PC9-cellichaam naarmate het celverspreidingsgebied toeneemt. De kleurenbalken geven de verplaatsingsgrootheid aan (karmozijnrood = hoge magnitude; zwart = lage magnitude) in (B, E, H, K). (C, F, I, L) Tractieveld (overlapt met het heldere veldbeeld) berekend op basis van het verplaatsingsveld. De tractie is geconcentreerd aan de periferie van PC9-cellen. De kleurenbalken geven tractiemagnitude aan (karmozijnrood = hoge magnitude; zwart = lage magnitude) in (C, F, I, L). Schaalbalken = 20 μm. Afkortingen: YAP = Yes-associated protein; PAA = polyacrylamide. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Het beeldvormingsproces (stap 6.3) is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de fluorescentiebeelden van voldoende goede kwaliteit zijn om geldige kwantificeringsresultaten op te leveren. De z-stack-afbeeldingen van fluorescerend eiwit of kralen moeten een z-bereik hebben dat groot genoeg is om de scherpgestelde beelden op te nemen voor alle Z-posities die het monster overspant. Een andere kritische stap is het verzamelen van de referentiebeelden van fluorescerende kralen na het oplossen van de cellen (stap 6.5). Omdat de referentiebeelden op dezelfde posities in stap 6.3 moeten worden gemaakt, mag er geen relatieve verplaatsing worden geïnduceerd tussen de petrischaal, de omgevingskamer en de microscoop. De onderzoekers die de oplosstap uitvoeren, moeten voorzichtig zijn om het deksel van de petrischaal te verwijderen en ervoor te zorgen dat de toegepaste mechanische verstoring niet groot genoeg is om de locatie van de schotel in de omgevingskamer te veranderen.

Hieronder vindt u oplossingen om enkele fouten op te lossen die tijdens experimenten kunnen optreden. Als er geen macro is geactiveerd nadat u in stap 6.4 op Enter hebt geklikt, komt dit waarschijnlijk omdat het linkerondergedeelte van het scherm wordt ingenomen door een niet-elementvenster. In dat geval moet het linkerondergedeelte van het venster worden gewist, zodat macro’s kunnen worden geactiveerd in Elements. Een andere veel voorkomende fout is dat de afbeeldingen met een helder veld zwart lijken. Dit probleem wordt veroorzaakt door een onvoldoende tijdsinterval tussen de acquisities van fluorescentie en helderveldbeelden. Kleine vertragingen in het tellen van de fluorescentiebeeldtijd kunnen zich in de loop van de tijd ophopen en aanzienlijke vertragingen veroorzaken en de beeldvorming van het heldere veld verstoren. Een oplossing is om de duur van één beeldvormingscyclus van alle posities aan te passen aan (niet gelijk aan) het tijdsinterval tussen het begin van opeenvolgende bewegingen. Met deze bewerking wordt de tijdtelling vernieuwd en wordt de cumulatieve fout aan het begin van elke beeldvormingscyclus geëlimineerd.

Deze volledig optische ondervragingstechnologie ondersteunt (1) een breed scala aan hardware/software, inclusief maar niet beperkt tot Nikon, (2) diverse soorten gevalideerde hydrogelsystemen, waaronder gelatine, PEG, Matrigel en collageen I-gels, en (3) de programmeerbare aanpassing op basis van verschillende behoeften van onderzoekers. Als een van de besturingsfuncties op het onderste niveau echter niet beschikbaar is via een commerciële microscoop, wordt het aanpassen van de functies met AMFIP een uitdaging. Een andere beperking van deze techniek is de ruimtelijke drift van het monster in zowel het XY- als het focusvlak (Z). Hoewel deze beperking kan worden overwonnen tijdens de nabewerking van de afbeeldingen, is het essentieel om de autofocusfunctie te verbeteren om de real-time drift van de monsters te corrigeren. Deze verbetering verhoogt de doorvoer van het beeldvormingsproces en vermindert de potentiële fout veroorzaakt door de drift tijdens experimenten.

Mechanotransducers, zoals YAP, kunnen dienen als nieuwe therapeutische doelen voor de ontwikkeling van veelbelovende kankertherapieën25,26,27. Opkomende gegevens suggereren dat YAP de proliferatie en invasie van kankercellen bevordert. Door de mechanica geïnduceerde YAP-translocatie van het cytoplasma naar de kern activeert de transcriptie van genen die verband houden met celmigratie, proliferatie, invasie en apoptose, wat leidt tot afwijkend celgedrag28,29,30,31. Dit werk was gericht op het onderzoeken van de potentiële correlatie van de YAP N / C-verhouding en celmechanica in twee typische menselijke longkanker en normale cellijnen. Tijdens de 10 uur celverspreidingsperiode vertonen PC9-cellen vergelijkbare YAP-concentraties in de kern en het cytoplasma (figuur 3D es figuur 5A). B2B-cellen vertonen een hogere YAP-concentratie in de kern dan in het cytoplasma (figuur 3C es figuur 5A). Deze relatie gevonden tijdens de vroege verspreidingsfase verschilt van de meerderheid van de gepubliceerde bevindingen die de YAP-concentratie in de kern tussen normale en kankercellen vergelijken. Hoewel niet noodzakelijkerwijs in het vroege verspreidingsstadium, tonen de meeste gepubliceerde bevindingen aan dat YAP meer geconcentreerd is in de kern van kankercellen dan in de kern van normale cellen27,28. Slechts één studie over borstkanker rapporteerde een uitzondering32 die aantoont dat YAP meer geconcentreerd is in het cytoplasma, wat overeenkomt met onze huidige waarnemingen in pc9-cellen van longkanker. Voor zover de auteurs weten, is dit werk het eerste dat een lagere YAP N / C-ratio laat zien in een menselijke longkankercellijn. De auteurs veronderstellen dat de reden voor een stabiele YAP N / C-verhouding in PC9-cellen te wijten kan zijn aan de lage variatie in het cel / kernverspreidingsgebied en tractie in PC9-cellen in het vroege verspreidingsstadium. De dissectie van de onderliggende moleculaire mechanismen van lage YAP N / C-verhouding in PC9- en B2B-cellen is aan de gang.

Tijdens de eerste 10 uur van de verspreiding vertonen deze twee cellijnen een duidelijke relatie tussen de YAP N/C-verhouding, celtractie en verspreidingsgebied (figuur 5). Voor B2B-cellen is een hogere YAP N/C-verhouding gecorreleerd met een hoger cel- en kernspreidingsgebied (figuur 6A,B), wat consistent is met de gerapporteerde gegevens van andere normale cellen33. Interessant is dat, hoewel de ontwikkelingstrend van deze relatie over het algemeen wordt gevonden in alle B2B-cellen die zijn geregistreerd, twee verschillende graden (hoog en laag) van deze relatie worden gevonden. B2B-cellen die zich tegelijkertijd verspreiden en migreren, vertonen een lagere tractie en een hoger cel- en kernverspreidingsgebied met een hogere YAP N / C-verhouding (2,05 ± 0,32). Voor B2B-cellen die zich verspreiden en op dezelfde locatie blijven, vertonen ze een hogere tractie en een lager cel- en kernverspreidingsgebied met een lagere YAP N / C-verhouding (1,74 ± 0,21). Deze twee graden van relaties worden aangetoond in de gespleten verspreide gegevensgroepen (figuur 6C,D). Zoals gemeld in de literatuur, hebben stationaire normale cellen, zoals embryonale fibroblast NIH 3T3-cellen, een hogere tractie dan migrerende cellen34. De gegevens die in dit artikel worden gerapporteerd, suggereren dat de zich verspreidende en niet-migrerende B2B-cellen een hogere tractie toepasten dan verspreidende en migrerende B2B-cellen, wat waarschijnlijk suggereert dat hoge tractie nodig is voor niet-migrerende cellen om zich op het substraat te stabiliseren.

Bovendien tonen deze gegevens aan dat stationaire normale B2B-cellen een hogere peri-nucleaire kracht genereren, terwijl eerder onderzoek uitgevoerd door andere onderzoekers alleen hogere celtractie meldde die werd gegenereerd aan de periferie van stationaire cellen34,35,36,37. De auteurs denken dat het verschil in de intrinsieke neiging van migratie in de experimenten deze tegenstrijdige resultaten kan veroorzaken. In de gepubliceerde experimenten was vierkante micropatterning gebruikt om te voorkomen dat afzonderlijke cellen zich verspreiden en migratie remmen; of de cellen de neiging hadden om te migreren is onbekend. Aangezien migrerende cellen vaak een hoge tractiekracht vertonen aan de periferie van de cellen38, is het waarschijnlijk dat cellen met de neiging om te migreren nog steeds een hoge periferietractie zullen behouden, ook al is hun migratie beperkt. In deze huidige studie worden de stationaire cellen niet beperkt door een micropattern, maar migreren ze niet, wat aangeeft dat de cellen de neiging hebben om hun niet-migrerende toestand te behouden. Een andere mogelijkheid is dat de celvorm gedefinieerd door het micropatroon de verdeling van focale verklevingen en trekkrachten kan beïnvloeden39. De resultaten in deze studie werden gegenereerd zonder enige beperkende micropatterning en vertegenwoordigen de krachtverdeling van stationaire cellen in hun oorspronkelijke vorm.

Voor zover de auteurs weten, meldde slechts één publicatie tot nu toe specifiek de vondst van peri-nucleaire krachten in normale cellen (embryonale fibroblasten van muizen), mogelijk veroorzaakt door de actinekap die zich over de nucleus uitstrekt40. YAP cytoplasma-naar-kern translocatie is gecorreleerd met de toename van peri-nucleaire kracht40. Een grondige zoektocht van de relevante literatuur leverde geen publicaties op die melding maken van een peri-nucleaire kracht of de actinecap in kankercellen. Een indirecte studie naar melanoomkankercellen toonde aan dat de actinerand (een andere peri-nucleaire actine-organisatie die zich rond maar niet in de kern bevindt) de celmigratiesnelheden vermindert41, wat indirect het bestaan van een peri-nucleaire kracht suggereert. Er worden echter geen directe experimentele gegevens gerapporteerd. In deze studie ontdekten de auteurs dat zowel PC9- als B2B-cellen peri-nucleaire verplaatsing en tractie vertonen. De mechanismen van het genereren van de peri-nucleaire krachten en hun effecten blijven controversieel. In normale cellen werd gemeld dat de actinecap een rol speelde bij het reguleren van de morfologie van de kern en de chromatineorganisatie42, het overbrengen van mechanische signalen van focale verklevingen naar de kern via linkers van nucleoskelet en cytoskelet (LINC) complex43, en het reguleren van celmigratie44. Lamin A/C is gerelateerd aan de vorming en verstoring van de actine cap40,41,42,43,44. Het rapport dat beweerde dat de actin cap een peri-nucleaire kracht genereert, hield echter geen rekening met de potentiële rol van de actine rim40. In kankercellen vergemakkelijkt overexpressie van lamin A de vorming van een actinerand en beperkt de migratie van kankercellen. Overexpressie van Lamin B vermindert actine velgvorming en bevordert migratie. De peri-nucleaire kracht kan bij dit proces betrokken zijn vanwege het bestaan van peri-nucleaire actine-organisatie en het effect van Lamin A. De resultaten van deze studie toonden echter geen bewijs van gemeten peri-nucleaire krachten of het gedrag van de actinecap. Daarom is de ontdekking van peri-nucleaire krachten in PC9-cellen in deze huidige studie het eerste rapport dat peri-nucleaire krachten en verplaatsingen in longkankercellen laat zien. De auteurs onderzoeken momenteel de moleculaire mechanismen en functies van peri-nucleaire krachten in CRISPR / Cas9-engineered PC9- en B2B-cellen.

Naast de volledig optische mechanobiologische ondervraging die in dit artikel wordt gedemonstreerd, kan het geïntegreerde multifunctionele systeem worden toegepast om optisch een groot aantal andere essentiële fysiologische en pathologische signalen in levende systemen te onderzoeken. Het laboratorium van de auteurs heeft bijvoorbeeld onlangs meerdere stabiel getransduceerde menselijke kankercellijnen vastgesteld die drie lichtgevoelige membraaneiwitten co-uitdrukken: membraanspanningsindicator QuasAr2 (excitatie: 640 nm; emissie: 660 nm-740 nm), membraanspanningsdepolarizer CheRiff (excitatie: 488 nm) en membraanspanningshyperpolarizer eNpHR3 (excitatie: 590 nm). Deze drie functionele eiwitten kunnen worden geactiveerd door spectrum-orthogonale laserlijnen op een kruisverwijzingsvrije manier, waardoor volledig optische tweerichtingssignaleringscommunicatie (uitlezing en controle) van membraanelektrofysiologie mogelijk is. Met behulp van een geïntegreerd opto-elektronisch systeem en een handmatige patch-clamp hebben de auteurs de volledig optische controle en uitlezing van de membraanspanning (Vm) in enkele menselijke kankercellen en meercellige tumorsferoïden gevalideerd. De volledig optische elektrofysiologische ondervraging opent de mogelijkheid voor gedetailleerde verkenningen van voorheen ontoegankelijke bio-elektriciteit in kankercellen, die de tumorbiologie van een nieuwe as kunnen helpen bevorderen.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit project wordt financieel ondersteund door de Cancer Pilot Award van UF Health Cancer Center (X. T. en D. S.) en het Gatorade Award Start-up Package (X. T.). De auteurs waarderen oprecht de intellectuele discussies met en de technische ondersteuning van Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Ji-Hyun Lee (Biostatistiek, UF), Dr. Hugh Fan (MAE, UF), Dr. Warren Dixon (MAE, UF), Dr. Ghatu Subhash (MAE, UF), Dr. Mark Sheplak (MAE & ECE, UF), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE, UF), Dr. Scott Banks (MAE, MAE, UF), Dr. Matthew Traum (MAE, UF), Dr. David Hahn (Universiteit van Arizona), Dr. Weihong Wang (Oracle Corporation), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Polytechnic University) en het ondersteuningsteam van Nikon (Drs. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon en Jon Ekman). De auteurs zijn zeer dankbaar voor de genereuze en effectieve steun van alle leden van Tang’s, Siemann’s en Guan’s onderzoekslaboratoria en alle medewerkers van de MAE & ECE & Physics & Radiation Oncology Departments, UF.

Materials

(3-Aminopropyl)triethoxysilane Sigma-aldrich 440140
0.05 % Trypsin Corning 25-051-CI
75 cm2 flask Corning 430641U
8 Benchtop Centrifuge Thermo 75007210
A1R confocal system Nikon HD25
Acetic acid Sigma-aldrich 695092 glacial, ACS reagent, ≥99.7%
BEAS-2B (B2B) cells Sigma-aldrich 95102433 human epithelial cells from lung tissue
Carboxylate-Modified Microspheres Invitrogen F8797
Culture medium (RPMI-1640) Gibco 11875093
Desktop Computer Dell 2018 with Windows 10 operating system
Environmental chamber TIZB Tokai Hit TIZB
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140
Fibronectin Human Protein, Plasma Gibco 33016015
Fiji ImageJ National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation 1.53k
Glass-bottom petri dish MatTek P35G-1.5-14-C
HEPES buffered saline Sigma-aldrich 51558
Hydrazine hydrate solution Sigma-aldrich 53847
IntelliJ IDEA JetBrains 2020 Java development platform
Java Development Kit Oracle 14.0
Kimwipe Kimtech Science 3066-05
MATLAB MathWorks 2020b
Monochrome Camera FLIR BFS-U3-70S7M-C
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit Lonza LT07-218
N,N′-Methylenebisacrylamide solution Sigma-aldrich M1533
NIS-Elements software platform Nikon 4.50 software platform
Origin OriginLab OriginPro 2017 (Learning Edition) data analysis and graphing software
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122
PC9 cells Sigma-aldrich 90071810 human adenocarcinoma cells  from lung tissue
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs  F-553S high-fidelity DNA polymerase
Scotch tape Scotch adhesive tape
Sodium dodecyl sulfate solution Sigma-aldrich 05030
Super glue Gorilla cyanoacrylate glue
Ti2-E inverted microscope Nikon MEA54000
TI2-S-SE-E Motorized Stage with Encoder Nikon MEC56120
μManager version 2.0 gamma open source microscopy software (https://micro-manager.org/)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Werley, C., Boccardo, S., Rigamonti, A., Hansson, E., Cohen, A. Multiplexed optical sensors in arrayed islands of cells for multimodal recordings of cellular physiology. Nature Communications. 11 (1), 3881 (2020).
  2. Yang, B., et al. Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution. Nature Methods. 16 (6), 501-504 (2019).
  3. Saraswathibhatla, A., Galles, E. E., Notbohm, J. Spatiotemporal force and motion in collective cell migration. Scientific Data. 7 (1), 197 (2020).
  4. Saraswathibhatla, A., Henkes, S., Galles, E. E., Sknepnek, R., Notbohm, J. Coordinated tractions control the size of a collectively moving pack in a cell monolayer. Extreme Mechanics Letters. 48, 101438 (2021).
  5. Wang, W., Kim, C. K., Ting, A. Y. Molecular tools for imaging and recording neuronal activity. Nature Chemical Biology. 15 (2), 101-110 (2019).
  6. Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).
  7. Carpenter, A. E., Kamentsky, L., Eliceiri, K. W. A call for bioimaging software usability. Nature Methods. 9 (7), 666-670 (2012).
  8. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. 34 (11), 1137-1144 (2016).
  9. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  10. Luo, Q., et al. Automatic multi-functional integration program (AMFIP) towards all-optical mechanobiology interrogation. bioRxiv. , (2021).
  11. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using manager. Current Protocols in Molecular Biology. 92 (1), 14-20 (2010).
  12. Tulpule, A., et al. Kinase-mediated RAS signaling via membraneless cytoplasmic protein granules. Cell. 184 (10), 2649-2664 (2021).
  13. Tang, X., Tofangchi, A., Anand, S. V., Saif, T. A. A novel cell traction force microscopy to study multi-cellular system. PLOS Computational Biology. 10 (6), 1003631 (2014).
  14. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  15. Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews Materials. 5, 351-370 (2020).
  16. Phelps, E. A., et al. Maleimide cross-linked bioactive PEG hydrogel exhibits improved reaction kinetics and cross-linking for cell encapsulation and in situ delivery. Advanced Materials. 24 (1), 64-70 (2012).
  17. Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 95 (4), 1261-1269 (2010).
  18. Temples, M. N., Adjei, I. M., Nimocks, P. M., Djeu, J., Sharma, B. Engineered three-dimensional tumor models to study natural killer cell suppression. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (7), 4179-4199 (2020).
  19. Feng, S., et al. Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling. Nature Communications. 8, 370 (2017).
  20. Guan, J., Liu, H., Shi, X., Feng, S., Huang, B. Tracking multiple genomic elements using correlative CRISPR imaging and sequential DNA FISH. Biophysical Journal. 112 (6), 1077-1084 (2017).
  21. . Micro-Manager Available from: https://micro-manager.org/wiki/NikonTi2 (2021)
  22. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  23. Martiel, J. L., et al. Measurement of cell traction forces with ImageJ. Methods in Cell Biology. 125, 269-287 (2015).
  24. Okumurai, I. A. On the generalization of Cerruti’s problem in an elastic half-space. Doboku Gakkai Ronbunshu. 1995, 1-10 (1995).
  25. Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond. Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).
  26. Hong, W. W., Guan, K. L. The YAP and TAZ transcription co-activators: Key downstream effectors of the mammalian Hippo pathway. Seminars in Cell and Developmental Biology. 23 (7), 785-793 (2012).
  27. Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. YAP/TAZ at the roots of cancer. Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).
  28. Wang, Y., et al. Overexpression of yes-associated protein contributes to progression and poor prognosis of non-small-cell lung cancer. Cancer Science. 101 (5), 1279-1285 (2010).
  29. Li, H., et al. Inhibition of YAP suppresses CML cell proliferation and enhances efficacy of imatinib in vitro and in vivo. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 35 (1), 134 (2016).
  30. Tang, X., et al. A mechanically-induced colon cancer cell population shows increased metastatic potential. Molecular Cancer. 13, 131 (2014).
  31. Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 758-770 (2017).
  32. Yuan, M., et al. Yes-associated protein (YAP) functions as a tumor suppressor in breast. Cell Death and Differentiation. 15 (11), 1752-1759 (2008).
  33. Koushki, N., et al. Lamin A redistribution mediated by nuclear deformation determines dynamic localization of YAP. bioRxiv. , (2020).
  34. Chang, S. S., Rape, A. D., Wong, S. A., Guo, W. H., Wang, Y. L. Migration regulates cellular mechanical states. Molecular Biology of the Cell. 30 (26), 3104-3111 (2019).
  35. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
  36. Lee, J., Abdeen, A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow. Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).
  37. Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. How far cardiac cells can see each other mechanically. Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).
  38. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  39. Rape, A., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2011).
  40. Shiu, J. Y., Aires, L., Lin, Z., Vogel, V. Nanopillar force measurements reveal actin-cap-mediated YAP mechanotransduction. Nature Cell Biology. 20 (3), 262-271 (2018).
  41. Fracchia, A., Asraf, T., Salmon-Divon, M., Gerlitz, G. Increased lamin B1 levels promote cell migration by altering perinuclear actin organization. Cells. 9 (10), 2161 (2020).
  42. Ramdas, N. M., Shivashankar, G. V. Cytoskeletal control of nuclear morphology and chromatin o1rganization. Journal of Molecular Biology. 427 (3), 695-706 (2015).
  43. Khatau, S. B., et al. A perinuclear actin cap regulates nuclear shape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19017-19022 (2009).
  44. Kim, D. H., Cho, S., Wirtz, D. Tight coupling between nucleus and cell migration through the perinuclear actin cap. Journal of Cell Science. 127 (11), 2528-2541 (2014).

Tags

MechanobiologyYes-associated ProteinCancer CellsNormal CellsMulti-functional SystemOptical ElectrophysiologySuper-resolution ImagingLive-cell ImagingHigh-throughputSelf-drift CorrectingLong-term ImagingFluorescent MicroscopyNYCOMEnvironment ChamberMotorized StageCO2 FlowTemperature ControlGlass-bottom Petri DishConfocal ControllerMicroManagerAdhesive TapeAdhesive GlueIntelliJAMFIP

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Luo, Q., Huang, M., Liang, C., Zhang, J., Lin, G., Yu, S., Tanaka, M., Lepler, S., Guan, J., Siemann, D., Tang, X. All-optical Mechanobiology Interrogation of Yes-associated Protein in Human Cancer and Normal Cells using a Multi-functional System. J. Vis. Exp. (178), e62934, doi:10.3791/62934 (2021).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image