استجواب علم الأحياء الميكانيكي البصري الشامل للبروتين المرتبط ب Yes في السرطان البشري والخلايا الطبيعية باستخدام نظام متعدد الوظائف
Summary
تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا تدريجيا حول كيفية استخدام نظام متكامل متعدد الوظائف وقابل للبرمجة من قبل المستخدم يمكن التصوير التلقائي متعدد القنوات والتحليل الميكانيكي البيولوجي لتوضيح الحساسية الميكانيكية للبروتين المرتبط ب Yes (YAP).
Abstract
يتطلب التصوير والتحليل متعدد الوظائف طويل الأجل للخلايا الحية تنسيقا مبسطا ووظيفيا لمختلف منصات الأجهزة والبرمجيات. ومع ذلك ، فإن التحكم اليدوي في المعدات المختلفة التي تنتجها مختلف الشركات المصنعة يتطلب عمالة كثيفة وتستغرق وقتا طويلا ، مما قد يقلل من دقة البيانات المكتسبة وقابليتها للتكرار وجودتها. لذلك ، فإن النظام المتكامل والقابل للبرمجة من قبل المستخدم والذي يتيح الحصول على صور تلقائية ومتعددة الوظائف وطويلة الأجل ومتوافق مع معظم منصات الفحص المجهري الفلوري يمكن أن يفيد المجتمع العلمي. تقدم هذه الورقة بروتوكولات التشغيل الكاملة لاستخدام نظام برمجي متكامل جديد يتكون من (1) برنامج برمجي محلي الصنع ، بعنوان “برنامج التكامل التلقائي متعدد الوظائف (AMFIP)” ، والذي يتيح الحصول التلقائي على التصوير متعدد القنوات ، و (2) مجموعة من التحليل الكمي للتصوير وحزم حساب الجر الخلوي.
يتم تطبيق هذا النظام المتكامل للكشف عن العلاقة غير المعروفة سابقا بين التوزيع المكاني والزماني للبروتين المرتبط ب Yes الحساس للميكانو (YAP) وميكانيكا الخلايا ، بما في ذلك انتشار الخلايا والجر ، في الخلايا الطبيعية البشرية المهندسة CRISPR / Cas9 (B2B) وخلايا سرطان الرئة (PC9). وبالاستفادة من قدرة هذا النظام على التحكم والقراءة متعددة القنوات، تظهر النتيجة ما يلي: (1) تظهر الخلايا الطبيعية B2B والخلايا السرطانية PC9 علاقة متميزة بين التعبير YAP والجر وديناميكيات الخلايا أثناء عمليات انتشار الخلايا وهجرها؛ و (2) تطبق الخلايا السرطانية PC9 قوى ملحوظة شبه نووية على الركائز. باختصار ، تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا تدريجيا حول كيفية استخدام نظام متكامل قابل للبرمجة من قبل المستخدم يمكن التصوير والتحليل التلقائي متعدد الوظائف لتوضيح حساسية ميكانو YAP. تفتح هذه الأدوات إمكانية الاستكشافات التفصيلية لديناميكيات الإشارات متعددة الأوجه في سياق فسيولوجيا الخلية وعلم الأمراض.
Introduction
الهدف العام لهذه الطريقة هو تمكين التصوير البصري متعدد الوظائف وتحليل الخلايا الحية. برنامج التصوير الكل في واحد الذي يتيح التنسيق التلقائي للأجهزة الإلكترونية البصرية متعددة الوظائف سيقلل من العمليات اليدوية كثيفة العمالة والمعرضة للخطأ وهو ضروري للباحثين لإجراء تصوير طويل الأجل للخلايا الحية1،2،3،4. ومع ذلك ، فإن معظم البرامج العامة الحالية في مجتمع البحوث الطبية الحيوية إما تنطبق فقط على الأجهزة الإلكترونية البصرية المحدودة أو تتطلب أجهزة إضافية لتنسيق المعدات المختلفة5،6،7،8،9. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير برنامج مفتوح المصدر وقائم على البرمجيات ، بعنوان “برنامج التكامل التلقائي متعدد الوظائف (AMFIP)” ، مما يتيح التصوير متعدد القنوات والفاصل الزمني. استنادا إلى لغة Java وواجهة برمجة التطبيقات (API) الخاصة ب μManager11,12 ، تم تطوير AMFIP كمكون إضافي في μManager يقوم بتنفيذ نصوص Java مخصصة لإنجاز الاتصالات القائمة على البرامج للعديد من الأجهزة الإلكترونية البصرية ومنصات البرامج ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر تلك الموجودة في Nikon. ويتيح إنشاء هذا البرنامج إمكانية إجراء استجواب قابل للبرمجة ومتعدد الوظائف لسلوكيات الخلايا. تم تطوير نظام تجريبي وحسابي متكامل في هذه الورقة ويجمع بين AMFIP وتحليل التصوير الرقمي والفحص المجهري لقوة الجر الخلوي. يتيح النظام توضيح البيولوجيا الميكانيكية YAP المميزة في خطوط الخلايا الطبيعية B2B البشرية (الشكل 1) وسرطان الرئة PC9 (الشكل 2) المهندسة من قبل CRISPR / Cas9. يوفر النظام للمجتمع العلمي حلا شاملا يتجنب الطلب على شراء أجهزة تحكم إضافية قد لا تكون متاحة و / أو متوافقة مع كل نظام تصوير.
تقدم البروتوكولات المقدمة في هذه الورقة كيفية (1) تطبيق AMFIP لإجراء تصوير تلقائي طويل الأجل لكل من خطوط الخلايا المصممة بواسطة CRISPR / Cas9 والتي تعبر عن YAP الموسومة ب mNEonGreen2 ؛ و (2) الجمع بين فيجي ImageJ و MATLAB و Origin للتحليل الكمي لنسبة YAP النووية / السيتوبلازم (N / C) بناء على شدتها الفلورية (الشكل 3 والشكل 4) ، ومجال الإزاحة الخلوية (الشكل 1C والشكل 2C) ، ومجال الجر الخلوي (الشكل 1D والشكل 2D ). تشير النتائج إلى أنه (1) خلال أول 10 ساعات من انتشار الخلايا على الركائز التي لها صلابة ميكانيكية ذات صلة فسيولوجية13،14،15،16،17،18 ، تظهر نسبة YAP N / C للخلايا B2B المفردة تباينا وتقلبا أكثر وضوحا يعتمد على الوقت مقارنة بخلايا PC9 المفردة (الشكل 5 والشكل 6 ); و (2) تولد الخلايا السرطانية PC9 قوة جذب ملحوظة في مناطقها المحيطة بالطاقة النووية (الشكل 7). يتجاوز النظام المتكامل والمنهجيات الموصوفة في هذا البروتوكول الأنواع المحددة من الخلايا والجزيئات البصرية الوراثية. يمكن للباحثين تطبيق البروتوكولات لتخصيص تجارب استجواب الخلايا الحية المحددة الخاصة بهم وتوضيح ديناميكيات الإشارات متعددة الأوجه في سياق فسيولوجيا الخلية وعلم الأمراض.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعد عملية التصوير (الخطوة 6.3) أمرا بالغ الأهمية لضمان أن تكون صور التألق ذات جودة جيدة بما يكفي للحصول على نتائج قياس كمي صالحة. يجب أن تحتوي صور z-stack للبروتين الفلوري أو الخرز على نطاق z كبير بما يكفي لتضمين الصور في التركيز البؤري لجميع مواضع Z التي تمتد عليها العينة. خطوة حاسمة أخرى هي جمع الصور المرجعية للحبات الفلورية بعد إذابة الخلايا (الخطوة 6.5). نظرا لأن الصور المرجعية تحتاج إلى التقاطها في نفس المواضع في الخطوة 6.3 ، فلا ينبغي إحداث إزاحة نسبية بين طبق بتري وغرفة البيئة والمجهر. يجب على المحققين الذين يقومون بخطوة الذوبان أن يكونوا حريصين على إزالة غطاء طبق بتري والتأكد من أن الاضطراب الميكانيكي المطبق ليس كبيرا بما يكفي لتغيير موقع الطبق في غرفة البيئة.
يتم توفير الحلول أدناه لحل بعض الأخطاء التي قد تحدث أثناء التجارب. إذا لم يتم تنشيط أي ماكرو بعد النقر فوق Enter في الخطوة 6.4 ، فمن المرجح أن يكون ذلك لأن المنطقة السفلية اليسرى من الشاشة مشغولة بنافذة غير Element. في مثل هذه الحالة ، يجب مسح المنطقة السفلية اليسرى من النافذة بحيث يمكن تنشيط وحدات الماكرو في Elements. خطأ شائع آخر هو أن صور المجال الساطع تظهر باللون الأسود. تحدث هذه المشكلة بسبب عدم كفاية الفاصل الزمني بين عمليات اكتساب التألق وصور المجال الساطع. يمكن أن تتراكم التأخيرات الطفيفة في حساب وقت التصوير الفلوري بمرور الوقت وتسبب تأخيرات كبيرة وتتداخل مع التصوير الساطع المجال. أحد الحلول هو ضبط مدة دورة تصوير واحدة لجميع المواضع لتكون أقل من (لا تساوي) الفاصل الزمني بين بدء الحركات المتتالية. تقوم هذه العملية بتحديث حساب الوقت وإزالة الخطأ التراكمي في بداية كل دورة تصوير.
تدعم تقنية الاستجواب البصري بالكامل هذه (1) مجموعة واسعة من الأجهزة / البرامج ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر نيكون ، (2) أنواع متنوعة من أنظمة الهيدروجيل التي تم التحقق من صحتها ، بما في ذلك الجيلاتين ، و PEG ، و Matrigel ، و collagen I gels ، و (3) التخصيص القابل للبرمجة بناء على الاحتياجات المختلفة للباحثين. ومع ذلك ، إذا لم تكن أي من وظائف التحكم من المستوى السفلي متاحة من المجهر التجاري ، فإن تخصيص الوظائف باستخدام AMFIP يصبح تحديا. هناك قيد آخر لهذه التقنية وهو الانجراف المكاني للعينة في كل من مستوي XY والتركيز البؤري (Z). على الرغم من أنه يمكن التغلب على هذا القيد أثناء المعالجة اللاحقة للصور ، إلا أنه من الضروري تحسين وظيفة التركيز التلقائي لتصحيح انحراف العينات في الوقت الفعلي. سيؤدي هذا التحسين إلى زيادة إنتاجية عملية التصوير وتقليل الخطأ المحتمل الناجم عن الانجراف أثناء التجارب.
قد تكون محولات الطاقة الميكانيكية ، مثل YAP ، بمثابة أهداف علاجية جديدة لتطوير علاجات واعدة للسرطان25،26،27. تشير البيانات الناشئة إلى أن YAP يعزز انتشار وغزو الخلايا السرطانية. ينشط نقل YAP الناجم عن الميكانيكا من السيتوبلازم إلى النواة نسخ الجينات المتعلقة بهجرة الخلايا وانتشارها وغزوها وموت الخلايا المبرمج ، مما يؤدي إلى سلوكيات الخلايا الشاذة28،29،30،31. يهدف هذا العمل إلى استكشاف العلاقة المحتملة لنسبة YAP N / C وميكانيكا الخلايا في اثنين من سرطان الرئة البشري النموذجي وخطوط الخلايا الطبيعية. خلال فترة انتشار الخلايا لمدة 10 ساعات ، تظهر خلايا PC9 تركيزات YAP مماثلة في النواة والسيتوبلازم (الشكل 3D والشكل 5A). تظهر الخلايا B2B تركيز YAP أعلى في النواة منه في السيتوبلازم (الشكل 3C والشكل 5A). تختلف هذه العلاقة التي تم العثور عليها خلال مرحلة الانتشار المبكرة عن غالبية النتائج المنشورة التي تقارن تركيز YAP في النواة بين الخلايا الطبيعية والسرطانية. على الرغم من أنه ليس بالضرورة في مرحلة الانتشار المبكرة ، إلا أن معظم النتائج المنشورة تظهر أن YAP أكثر تركيزا في نواة الخلايا السرطانية منه في نواة الخلايا الطبيعية27,28. ذكرت دراسة واحدة فقط عن سرطان الثدي استثناء32 يظهر أن YAP أكثر تركيزا في السيتوبلازم ، وهو ما يتفق مع ملاحظاتنا الحالية التي تم إجراؤها في خلايا PC9 لسرطان الرئة. على حد علم المؤلفين ، هذا العمل هو الأول الذي يظهر نسبة YAP N / C أقل في خط خلايا سرطان الرئة البشرية. يفترض المؤلفون أن سبب استقرار نسبة YAP N / C في خلايا PC9 قد يكون بسبب التباين المنخفض في منطقة انتشار الخلية / النواة والجر في خلايا PC9 في مرحلة الانتشار المبكرة. تشريح الآليات الجزيئية الأساسية لنسبة YAP N / C المنخفضة في خلايا PC9 و B2B مستمر.
خلال أول 10 ساعات من الانتشار ، يظهر هذان الخطان الخلويان علاقة متميزة بين نسبة YAP N / C ، وجر الخلية ، ومنطقة الانتشار (الشكل 5). بالنسبة للخلايا B2B، ترتبط نسبة YAP N/C الأعلى بمنطقة انتشار أعلى للخلايا والنواة (الشكل 6A,B)، وهو ما يتسق مع البيانات المبلغ عنها للخلايا الطبيعية الأخرى33. ومن المثير للاهتمام ، على الرغم من أن الاتجاه التنموي لهذه العلاقة موجود بشكل عام في جميع الخلايا B2B المسجلة ، إلا أنه تم العثور على درجتين مختلفتين (عالية ومنخفضة) لهذه العلاقة. تظهر الخلايا B2B التي تنتشر وتهاجر في وقت واحد قوة جر أقل ومنطقة انتشار أعلى للخلايا والنواة مع نسبة YAP N / C أعلى (2.05 ± 0.32). بالنسبة للخلايا B2B التي تنتشر وتبقى في نفس الموقع ، فإنها تظهر قوة جر أعلى ومنطقة انتشار أقل للخلايا والنواة مع نسبة YAP N / C أقل (1.74 ± 0.21). وتظهر هاتان الدرجتان من العلاقات في مجموعات البيانات المتناثرة المتشعبة (الشكل 6C,D). كما ورد في الأدبيات ، فإن الخلايا الطبيعية الثابتة ، مثل خلايا الخلايا الليفية الجنينية NIH 3T3 ، لها قوة جر أعلى من الخلايا المهاجرة34. تشير البيانات الواردة في هذه الورقة إلى أن الخلايا B2B المنتشرة وغير المهاجرة طبقت قوة جر أعلى من الخلايا B2B المنتشرة والمهاجرة ، مما يشير على الأرجح إلى أن هناك حاجة إلى قوة جر عالية للخلايا غير المهاجرة لتحقيق الاستقرار على الركيزة.
بالإضافة إلى ذلك ، تظهر هذه البيانات أن الخلايا B2B الطبيعية الثابتة تولد قوة أعلى حول النواة ، في حين أن الأبحاث السابقة التي أجراها باحثون آخرون ذكرت فقط زيادة الجر الخلوي المتولد في محيط الخلايا الثابتة34،35،36،37. يعتقد المؤلفون أن الاختلاف في الميل الجوهري للهجرة في التجارب قد يسبب هذه النتائج المتناقضة. وفي التجارب المنشورة، استخدمت الأنماط الدقيقة المربعة الشكل لتقييد الخلايا المفردة من الانتشار ومنع الهجرة؛ ومن غير المعروف ما إذا كانت الخلايا تميل إلى الهجرة. وبما أن الخلايا المهاجرة غالبا ما تظهر قوة جر عالية في محيط الخلايا38، فمن المرجح أن الخلايا التي تميل إلى الهجرة ستظل تحافظ على قوة جر عالية في المحيط على الرغم من أن هجرتها مقيدة. في هذه الدراسة الحالية ، لا يتم تقييد الخلايا الثابتة بأي نمط مجهري ولكنها لا تهاجر ، مما يشير إلى أن الخلايا تميل إلى الحفاظ على حالتها غير المهاجرة. وهناك احتمال آخر هو أن شكل الخلية الذي يحدده النمط المجهري قد يؤثر على توزيع الالتصاقات البؤرية وقوى الجر39. تم إنشاء النتائج في هذه الدراسة دون أي نمط مجهري مقيد وتمثل توزيع قوة الخلايا الثابتة في شكلها الأصلي.
وعلى حد علم المؤلفين، أفاد منشور واحد فقط حتى الآن على وجه التحديد عن اكتشاف قوى شبه نووية في الخلايا الطبيعية (الخلايا الليفية الجنينية الفئران)، والتي يحتمل أن تكون ناجمة عن غطاء الأكتين الممتد عبر النواة40. ويرتبط نقل السيتوبلازم إلى النواة YAP بزيادة القوة شبه النووية40. لم يسفر البحث الدقيق في الأدبيات ذات الصلة عن أي منشوراتتفيد عن قوة شبه نووية أو غطاء الأكتين في الخلايا السرطانية. أظهرت دراسة غير مباشرة أجريت على خلايا سرطان الجلد أن حافة الأكتين (منظمة أكتين أخرى شبه نووية تقع حول النواة ولكنها لا تغطيها) تقلل من معدلات هجرة الخلايا41، مما يشير بشكل غير مباشر إلى وجود قوة شبه نووية. ومع ذلك ، لا يتم الإبلاغ عن أي بيانات تجريبية مباشرة. في هذه الدراسة ، وجد المؤلفون أن كلا من خلايا PC9 و B2B تظهر الإزاحة والجر المحيطين بالنووي. ولا تزال آليات توليد القوى شبه النووية وآثارها مثيرة للجدل. وفي الخلايا الطبيعية، أفيد بأن غطاء الأكتين يلعب دورا في تنظيم مورفولوجيا النواة وتنظيم الكروماتين42، ونقل الإشارات الميكانيكية من الالتصاقات البؤرية إلى النواة من خلال روابط الهيكل العظمي النووي ومجمع الهيكل الخلوي (LINC)43، وتنظيم هجرة الخلايا44. يرتبط Lamin A/C بتكوين وتعطيل قبعة الأكتين40,41,42,43,44. ومع ذلك ، فإن التقرير الذي ادعى أن غطاء الأكتين يولد قوة شبه نووية لم يأخذ في الاعتبار الدور المحتمل للأكتين rim40. في الخلايا السرطانية ، يسهل الإفراط في التعبير عن Lamin A تكوين حافة الأكتين ويقيد هجرة الخلايا السرطانية. الإفراط في التعبير عن Lamin B يقلل من تكوين حافة الأكتين ويعزز الهجرة. وقد تشارك القوة شبه النووية في هذه العملية بسبب وجود تنظيم للأكتين شبه النووي وتأثير لامين ألف. ومع ذلك ، لم تظهر نتائج هذه الدراسة أي دليل على القوى شبه النووية المقاسة أو سلوك غطاء الأكتين. لذلك ، فإن اكتشاف القوى شبه النووية في خلايا PC9 في هذه الدراسة الحالية هو أول تقرير يظهر القوى شبه النووية والإزاحات في خلايا سرطان الرئة. يقوم المؤلفون حاليا بالتحقيق في الآليات والوظائف الجزيئية للقوى شبه النووية في خلايا PC9 و B2B المصممة بواسطة CRISPR / Cas9.
بالإضافة إلى استجواب علم الأحياء الميكانيكي البصري بالكامل الذي تم توضيحه في هذه الورقة ، يمكن تطبيق النظام المتكامل متعدد الوظائف للتحقيق بصريا في عدد لا يحصى من الإشارات الفسيولوجية والمرضية الأساسية الأخرى في الأنظمة الحية. على سبيل المثال ، أنشأ مختبر المؤلفين مؤخرا العديد من خطوط الخلايا السرطانية البشرية المحولة بثبات والتي تشترك في التعبير عن ثلاثة بروتينات غشائية مستجيبة للضوء: مؤشر جهد الغشاء QuasAr2 (الإثارة: 640 نانومتر ؛ الانبعاثات: 660 نانومتر – 740 نانومتر) ، مزيل الاستقطاب جهد الغشاء CheRiff (الإثارة: 488 نانومتر) ، وفرط الاستقطاب جهد الغشاء eNpHR3 (الإثارة: 590 نانومتر). يمكن تنشيط هذه البروتينات الوظيفية الثلاثة بواسطة خطوط الليزر المتعامدة الطيف بطريقة خالية من الأحاديث المتقاطعة ، مما يتيح اتصالات إشارات بصرية ثنائية الاتجاه (القراءة والتحكم) للفيزيولوجيا الكهربية الغشائية. باستخدام نظام إلكتروني بصري متكامل ومشبك رقعة يدوي ، قام المؤلفون بالتحقق من صحة التحكم البصري الكامل وقراءة جهد الغشاء (Vm) في الخلايا السرطانية البشرية المفردة وكرويات الورم متعددة الخلايا. يفتح استجواب الفيزيولوجيا الكهربية البصرية بالكامل إمكانية إجراء استكشافات مفصلة للكهرباء الحيوية التي كان يتعذر الوصول إليها سابقا في الخلايا السرطانية ، مما قد يساعد في تطوير بيولوجيا الورم من محور جديد.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم هذا المشروع ماليا من خلال جائزة السرطان التجريبية من مركز UF Health Cancer Center (X. T. و D. S.) وحزمة بدء التشغيل لجائزة Gatorade (X. T). يقدر المؤلفون بصدق المناقشات الفكرية والدعم الفني من الدكتور جوناثان ليخت (UFHCC) ، والدكتور رولف رين (UFHCC) ، والدكتور جي هيون لي (الإحصاء الحيوي ، UF) ، والدكتور هيو فان (MAE ، UF) ، والدكتور وارن ديكسون (MAE ، UF) ، والدكتور غاتو سوبهاش (MAE ، UF) ، والدكتور مارك شيبلاك (MAE & ECE ، UF) ، والدكتورة ماليسا سارنتينورانون (MAE ، UF) ، والدكتور سكوت بانكس (MAE ، UF) ، والدكتور ماثيو تراوم (MAE ، UF) ، والدكتور ديفيد هان (جامعة أريزونا) ، والدكتور Weihong Wang (شركة Oracle) ، والدكتور Youhua Tan (جامعة هونغ كونغ للفنون التطبيقية) ، وفريق الدعم من نيكون (الدكاترة خوسيه سيرانو فيليز ، لاري كوردون ، وجون إيكمان). يشعر المؤلفون بالامتنان العميق للدعم السخي والفعال من جميع أعضاء مختبرات أبحاث تانغ وسيمان وجوان وجميع موظفي أقسام MAE و ECE والفيزياء وعلم الأورام الإشعاعي ، UF.
Materials
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-aldrich | 440140 | |
| 0.05 % Trypsin | Corning | 25-051-CI | |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| 8 Benchtop Centrifuge | Thermo | 75007210 | |
| A1R confocal system | Nikon | HD25 | |
| Acetic acid | Sigma-aldrich | 695092 | glacial, ACS reagent, ≥99.7% |
| BEAS-2B (B2B) cells | Sigma-aldrich | 95102433 | human epithelial cells from lung tissue |
| Carboxylate-Modified Microspheres | Invitrogen | F8797 | |
| Culture medium (RPMI-1640) | Gibco | 11875093 | |
| Desktop Computer | Dell | 2018 | with Windows 10 operating system |
| Environmental chamber TIZB | Tokai Hit | TIZB | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140 | |
| Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fiji ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation | 1.53k | |
| Glass-bottom petri dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| HEPES buffered saline | Sigma-aldrich | 51558 | |
| Hydrazine hydrate solution | Sigma-aldrich | 53847 | |
| IntelliJ IDEA | JetBrains | 2020 | Java development platform |
| Java Development Kit | Oracle | 14.0 | |
| Kimwipe | Kimtech Science | 3066-05 | |
| MATLAB | MathWorks | 2020b | |
| Monochrome Camera | FLIR | BFS-U3-70S7M-C | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-218 | |
| N,N′-Methylenebisacrylamide solution | Sigma-aldrich | M1533 | |
| NIS-Elements software platform | Nikon | 4.50 | software platform |
| Origin | OriginLab | OriginPro 2017 (Learning Edition) | data analysis and graphing software |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PC9 cells | Sigma-aldrich | 90071810 | human adenocarcinoma cells from lung tissue |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | F-553S | high-fidelity DNA polymerase |
| Scotch tape | Scotch | adhesive tape | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma-aldrich | 05030 | |
| Super glue | Gorilla | cyanoacrylate glue | |
| Ti2-E inverted microscope | Nikon | MEA54000 | |
| TI2-S-SE-E Motorized Stage with Encoder | Nikon | MEC56120 | |
| μManager | version 2.0 gamma | open source microscopy software (https://micro-manager.org/) |
Referencias
- Werley, C., Boccardo, S., Rigamonti, A., Hansson, E., Cohen, A. Multiplexed optical sensors in arrayed islands of cells for multimodal recordings of cellular physiology. Nature Communications. 11 (1), 3881 (2020).
- Yang, B., et al. Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution. Nature Methods. 16 (6), 501-504 (2019).
- Saraswathibhatla, A., Galles, E. E., Notbohm, J. Spatiotemporal force and motion in collective cell migration. Scientific Data. 7 (1), 197 (2020).
- Saraswathibhatla, A., Henkes, S., Galles, E. E., Sknepnek, R., Notbohm, J. Coordinated tractions control the size of a collectively moving pack in a cell monolayer. Extreme Mechanics Letters. 48, 101438 (2021).
- Wang, W., Kim, C. K., Ting, A. Y. Molecular tools for imaging and recording neuronal activity. Nature Chemical Biology. 15 (2), 101-110 (2019).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).
- Carpenter, A. E., Kamentsky, L., Eliceiri, K. W. A call for bioimaging software usability. Nature Methods. 9 (7), 666-670 (2012).
- Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. 34 (11), 1137-1144 (2016).
- Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
- Luo, Q., et al. Automatic multi-functional integration program (AMFIP) towards all-optical mechanobiology interrogation. bioRxiv. , (2021).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using manager. Current Protocols in Molecular Biology. 92 (1), 14-20 (2010).
- Tulpule, A., et al. Kinase-mediated RAS signaling via membraneless cytoplasmic protein granules. Cell. 184 (10), 2649-2664 (2021).
- Tang, X., Tofangchi, A., Anand, S. V., Saif, T. A. A novel cell traction force microscopy to study multi-cellular system. PLOS Computational Biology. 10 (6), 1003631 (2014).
- Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
- Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews Materials. 5, 351-370 (2020).
- Phelps, E. A., et al. Maleimide cross-linked bioactive PEG hydrogel exhibits improved reaction kinetics and cross-linking for cell encapsulation and in situ delivery. Advanced Materials. 24 (1), 64-70 (2012).
- Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 95 (4), 1261-1269 (2010).
- Temples, M. N., Adjei, I. M., Nimocks, P. M., Djeu, J., Sharma, B. Engineered three-dimensional tumor models to study natural killer cell suppression. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (7), 4179-4199 (2020).
- Feng, S., et al. Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling. Nature Communications. 8, 370 (2017).
- Guan, J., Liu, H., Shi, X., Feng, S., Huang, B. Tracking multiple genomic elements using correlative CRISPR imaging and sequential DNA FISH. Biophysical Journal. 112 (6), 1077-1084 (2017).
- . Micro-Manager Available from: https://micro-manager.org/wiki/NikonTi2 (2021)
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Martiel, J. L., et al. Measurement of cell traction forces with ImageJ. Methods in Cell Biology. 125, 269-287 (2015).
- Okumurai, I. A. On the generalization of Cerruti’s problem in an elastic half-space. Doboku Gakkai Ronbunshu. 1995, 1-10 (1995).
- Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond. Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).
- Hong, W. W., Guan, K. L. The YAP and TAZ transcription co-activators: Key downstream effectors of the mammalian Hippo pathway. Seminars in Cell and Developmental Biology. 23 (7), 785-793 (2012).
- Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. YAP/TAZ at the roots of cancer. Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).
- Wang, Y., et al. Overexpression of yes-associated protein contributes to progression and poor prognosis of non-small-cell lung cancer. Cancer Science. 101 (5), 1279-1285 (2010).
- Li, H., et al. Inhibition of YAP suppresses CML cell proliferation and enhances efficacy of imatinib in vitro and in vivo. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 35 (1), 134 (2016).
- Tang, X., et al. A mechanically-induced colon cancer cell population shows increased metastatic potential. Molecular Cancer. 13, 131 (2014).
- Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 758-770 (2017).
- Yuan, M., et al. Yes-associated protein (YAP) functions as a tumor suppressor in breast. Cell Death and Differentiation. 15 (11), 1752-1759 (2008).
- Koushki, N., et al. Lamin A redistribution mediated by nuclear deformation determines dynamic localization of YAP. bioRxiv. , (2020).
- Chang, S. S., Rape, A. D., Wong, S. A., Guo, W. H., Wang, Y. L. Migration regulates cellular mechanical states. Molecular Biology of the Cell. 30 (26), 3104-3111 (2019).
- Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
- Lee, J., Abdeen, A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow. Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).
- Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. How far cardiac cells can see each other mechanically. Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Rape, A., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2011).
- Shiu, J. Y., Aires, L., Lin, Z., Vogel, V. Nanopillar force measurements reveal actin-cap-mediated YAP mechanotransduction. Nature Cell Biology. 20 (3), 262-271 (2018).
- Fracchia, A., Asraf, T., Salmon-Divon, M., Gerlitz, G. Increased lamin B1 levels promote cell migration by altering perinuclear actin organization. Cells. 9 (10), 2161 (2020).
- Ramdas, N. M., Shivashankar, G. V. Cytoskeletal control of nuclear morphology and chromatin o1rganization. Journal of Molecular Biology. 427 (3), 695-706 (2015).
- Khatau, S. B., et al. A perinuclear actin cap regulates nuclear shape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19017-19022 (2009).
- Kim, D. H., Cho, S., Wirtz, D. Tight coupling between nucleus and cell migration through the perinuclear actin cap. Journal of Cell Science. 127 (11), 2528-2541 (2014).
