卡诺哈布迪炎电子甘的多巴胺神经元形态变化和退化的量化水平

帕金森病（PD）是一种越来越常见的神经退行性疾病，^{影响全球多达}1000万人。男性和老年人患PD的风险较高：该病的平均发病年龄为60岁，PD发病率从一般人群的0.3%攀升至80岁以上^人群的3%。虽然PD病理学的细节尚未完全了解，但这种渐进性紊乱涉及中脑的亚斯坦蒂亚尼格拉区域多巴胺神经元的丧失。这种神经元损失的假设机制涉及线粒体功能障碍，氧化应激和炎症^2。疾病的原因和危险因素仍在探索中，但涉及环境因素和遗传因素的综合^作用。例如，研究发现终身使用农药和PD之间有正关联，以及家族性^PD1，3的遗传易感性。

C.elegans模型系统，最初开发的部分神经生物学研究^4，非常适合评估多巴胺神经元损失在体内。Nass和他的同事率先使用C.elegans进行多巴胺神经退化^5，此后许多团体已经采用蠕虫作为PD和多巴胺神经功能障碍^{6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17}的成功模型 ^{，18，19，20}。C. elegans是很好的神经退行性疾病模型，原因有很多，因为它们是其他生物学领域的流行模型有机体：它们的透明度允许在细胞过程的体内研究，蠕虫的基因操作是相对快速和容易的，他们有一个短的生成时间约三天，他们很容易保持^21。大多数PD蠕虫模型分为三类：基于年龄的模型、化学模型和基因模型。同步蠕虫种群的能力使得研究与年龄相关的神经退化，用于与衰老相关的神经退行性疾病的年龄模型，如^PD22。诱导PD类神经元缺陷的化学暴露是使用多种化学品建立的，包括6-羟基多巴胺（6-OHDA）、罗酮和1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢二烯^{（MPTP）22。}蠕虫也被成功地用作PD的基因模型：具有选择神经基因敲除的菌株可以模拟各种神经退行性疾病^1，4。基因和环境因素的组合，或”基因-环境相互作用”，可能发挥主要作用的PD 2，17，23，24，25，26，27，28，已经检查了几个组使用C.elegans。最后，年龄相关的多巴胺神经退化也观察到^29，30。如果在荧光成像中使用适当的神经转基因菌株，这些PD蠕虫模型中的任何一个都可以用于研究多巴胺神经退化。

量化神经元形态的变化是神经退行性研究的重要组成部分。在C.elegans，许多荧光记者菌株被用来可视化形态变化和神经元损失。适合神经元成像的菌株具有与细胞特异性促进剂相关的荧光蛋白。对于多巴胺神经退化检测，我们的实验室使用了 BY200 [vtIs1（dat-1p：：GFP， rol-6）] 菌株，该菌株在dat-1基因中具有绿色荧光蛋白 （GFP） 标签，在多巴胺神经元中表达。请注意，BY200 的滚筒表型具有非常低的穿透性，很少被观察到。用于此类成像的其他常见菌株包括 BY250[dat-1p：：GFP]， BY273 [baEx18 [dat-1p：：GFP]dat-1p：：WT α-syn]，BZ555 [egis1]dt-1p：：GFP]，以及其他几个可从卡诺哈布迪炎遗传学中心 （CGC） 或特定实验室^{1， 21，22}，²⁹的要求.这些菌株通常允许可视化所有三类多巴胺神经元：头孢神经元（CEP）、前二元神经元（ADE）和后二胺神经元（PDE）。C. elegans不自然地表达α核素蛋白，但像BY273这样的菌株已被设计来表达它。但是，我们注意到，我们目前的评分系统是使用 BY200 开发的，它不表示α核素，并且需要在使用之前用该菌株（或任何其他新菌株）进行验证。男性中存在额外的多巴胺神经元，但很少被考虑，因为男性通常占C.elegans种群的<1%。在这里，我们专注于在C.elegans的头部区域发现的四个CEP多巴胺神经元。这组神经元很容易位于荧光显微镜下，存在于草本虫和雄性蠕虫中，通常不会与其他自荧光区域重叠，并且通常在蠕虫研究中报道。值得注意的是，虽然这些神经元没有骨髓化，但CEP正点（CEPD）神经元直接暴露在伪腹腔体液中，而CEP腹腔神经元则不暴露于伪脑体液中。一组健康的 CEP 树突通常显示为相对直的、不间断的线条。退化的树突可能表现出任何不规则和损伤迹象的组合，包括沿着树突线的明显点称为斑点，并在树突线中断裂。CEP神经元在不同程度的退化的例子可以从图1中看到。

虽然多巴胺神经退化正在由越来越多的C.elegans实验室研究，但计算多巴胺神经元损伤的分析方法却存在很大差异^{，29、31、32、33、34。}许多发表的研究已经报告了CEP soma的存在或缺乏与典型或野生类型的神经元^31，32的退行性二元评分系统。这些评分方法可以识别某些诱导神经退化的压力源，但无法量化更微妙的神经元损伤进展的细节，或很容易检测由独特化学物质或其他变量诱导的神经退化之间的差异。此外，以细胞体为重点的评分系统可能对较不严重的损伤水平或仅影响部分细胞（如树突）的神经元损伤不敏感。由于树突似乎具有针对化学应激因素的一致可检测的莫克变变化的最大范围，因此我们选择了它们作为分析的基础。我们在这里的评分系统是修改从树突形态为基础的多点尺度，以前已经在我们的实验室^29，33使用。该系统将这些五点和六点尺度扩展为七点尺度，以考虑与年龄相关的形态变化，例如老年人树突中预期扭结数较高，并区分严重损伤和完全树突损失。引入这个评分系统的目的是提供在神经元损伤的各个层面捕捉神经退化的全面图像的能力，并提供一个通用系统来支持C.elegan多巴胺神经退化研究的一致性。因为评分本质上是主观的，因此必须最大限度地提高个人评分的一致性，并且使用手动致盲或自动致盲程序³⁵使评分者对图像的身份视而不见。为了提高一致性，我们展示了一系列培训图像，并利用 JoVE 的视频功能详细演示我们的评分系统。我们建议使用一个系统，既允许自动盲目得分，并允许得分手量化他或她的得分一致性，通过重新评分的图像子集。在组合或比较来自多个科学家的数据或培训新评分的科学家时，这一点尤其重要。