Utilisation de changements dans la transmission des feuilles pour étudier le mouvement des chloroplastes chez Arabidopsis thaliana

La lumière est essentielle à la photosynthèse, à la croissance et au développement des plantes. C’est l’un des facteurs abiotiques les plus dynamiques, car les intensités lumineuses changent non seulement au cours d’une saison ou d’une journée, mais aussi rapidement et de manière imprévisible en fonction de la couverture nuageuse. Au niveau des feuilles, les intensités lumineuses sont également influencées par la densité et la nature de la végétation environnante et de la canopée de la plante. Un mécanisme important qui permet aux plantes d’optimiser l’interception de la lumière dans des conditions de lumière variables est la capacité des chloroplastes à se déplacer en réponse aux stimuli de lumière ^bleue1,2. Dans des conditions de faible luminosité, les chloroplastes se propagent perpendiculairement à la lumière (le long des parois cellulaires périclinales) dans une réponse dite d’accumulation, maximisant l’interception de la lumière et donc la photosynthèse. Dans des conditions de forte luminosité, les chloroplastes se déplacent vers la paroi cellulaire anticlinale dans une réponse dite d’évitement, minimisant l’interception de la lumière et le danger de photoinhibition. Chez de nombreuses espèces, les chloroplastes adoptent également une position sombre spécifique, qui est distincte des positions d’accumulation et d’évitement et souvent intermédiaire entre ces ^deux3,4. Diverses études ont démontré que le mouvement des chloroplastes est important non seulement pour la tolérance au stress à court terme des feuilles5,6,7, mais aussi pour la croissance et le succès de reproduction des plantes, en particulier dans des conditions de lumière ^variables8,9.

Le mouvement des chloroplastes est facilement observé en temps réel dans certains spécimens vivants (p. ex. algues ou plantes à feuilles minces comme Elodea) à l’aide de la microscopie ^optique1. L’étude du mouvement des chloroplastes dans la plupart des feuilles, cependant, nécessite un prétraitement pour induire le mouvement des chloroplastes, la fixation chimique et la préparation des sections transversales avant de visualiser les échantillons au microscope ^optique10. Avec l’introduction de la microscopie laser confocale, il est également devenu possible d’imager la disposition 3D des chloroplastes dans des feuilles intactes ou fixes4,11,12. Ces techniques d’imagerie aident grandement à comprendre le mouvement des chloroplastes en fournissant des informations qualitatives importantes. La quantification du positionnement des chloroplastes (par exemple, en pourcentage des chloroplastes dans les positions périclinale ou anticlinale dans ces images ou en pourcentage de la surface couverte par les chloroplastes par surface cellulaire totale) est également possible, mais prend beaucoup de temps, surtout si elle est effectuée aux intervalles nécessaires pour capturer les changements rapides de ^{positionnement10,8} . Le moyen le plus simple de montrer si les feuilles adaptées à l’obscurité d’une certaine espèce ou de mutants sont capables de mouvement des chloroplastes dans la réponse d’évitement est de couvrir la majeure partie de la surface d’une feuille pour garder les chloroplastes dans l’obscurité tout en exposant une bande de la feuille à une lumière élevée. Après un minimum de 20 minutes d’exposition à la lumière élevée, les chloroplastes dans la zone exposée se seront déplacés en position d’évitement et la bande exposée sera visiblement de couleur plus claire que le reste de la feuille. Cela est vrai pour le type sauvage A. thaliana, mais pas pour certains des mutants du mouvement des chloroplastes décrits plus en détail plus ^loin13. Cette méthode et ses modifications (p. ex., inverser les parties de la feuille exposées, modifier l’intensité lumineuse) sont utiles pour dépister un grand nombre de mutants et pour identifier les mutants nuls qui n’ont pas la capacité de présenter une réponse d’évitement ou d’accumulation ou les deux. Cependant, il ne fournit pas d’informations sur les changements dynamiques dans le mouvement des chloroplastes.

En revanche, la méthode décrite ici permet de quantifier le mouvement des chloroplastes dans les feuilles intactes en utilisant les changements dans la transmission de la lumière à travers une feuille comme indicateur du mouvement global des chloroplastes: dans des conditions où les chloroplastes sont étalés dans les cellules mésophylles dans la réponse d’accumulation, moins de lumière est transmise à travers la feuille que lorsque de nombreux chloroplastes sont dans une réponse d’évitement, se positionner le long des parois cellulaires anticlinales. Par conséquent, les changements de transmission peuvent être utilisés comme indicateur du mouvement global des chloroplastes dans les ^feuilles14. Les détails de l’instrument sont décrits ailleurs (voir Dossier supplémentaire), mais fondamentalement, l’instrument utilise la lumière bleue pour déclencher le mouvement du chloroplaste et mesure la quantité de lumière rouge transmise à travers cette feuille à intervalles définis. Plus récemment, une modification de ce système a été décrite, qui utilise un lecteur de microplaques modifié de 96 puits, une LED bleue, un ordinateur et un incubateur à température ^{contrôlée15}.

L’option d’utiliser une combinaison de méthodes, y compris l’évaluation optique des feuilles pour le dépistage, suivie de la mesure des changements dynamiques dans la transmission et l’utilisation de la microscopie, a grandement aidé notre compréhension des mécanismes sous-jacents et de l’importance physiologique / écologique du mouvement des chloroplastes. Par exemple, cela a conduit à la découverte et à la caractérisation de divers mutants, qui sont altérés dans des aspects spécifiques de leurs mouvements. Par exemple, les mutants d’A. thaliana phot 1 n’ont pas la capacité d’accumuler leurs chloroplastes en basse lumière, tandis que les mutants de phot 2 n’ont pas la capacité d’effectuer une réaction d’évitement. Ces phénotypes sont dus à une altération de deux récepteurs de lumière bleue respectifs16,17,18. En revanche, les mutants chup1 n’ont pas la capacité de former des filaments d’actine appropriés autour des chloroplastes qui sont essentiels pour déplacer les chloroplastes dans la position souhaitée dans une ^cellule11,19. En plus des études mutantes, les chercheurs ont évalué les effets de divers inhibiteurs sur le mouvement des chloroplastes afin d’élucider les aspects mécanistes du processus. Par exemple, des produits chimiques tels que _H2O2 et divers antioxydants ont été utilisés pour étudier les effets de cette molécule de signalisation sur le mouvement des chloroplastes20. Divers inhibiteurs ont été utilisés pour élucider le rôle du calcium dans le mouvement des ^{chloroplastes21}. En plus d’aider à découvrir les mécanismes du mouvement des chloroplastes, ces méthodes peuvent être utilisées pour comparer le mouvement des chloroplastes chez diverses espèces ou mutants cultivés dans différentes conditions afin de tenter de comprendre le contexte écologique et évolutif de ce comportement. Par exemple, il a été démontré que l’étendue des effets de diverses mutations dans la voie de mouvement des chloroplastes dépend des conditions de ^{croissance7,9}, et que les plantes adaptées au soleil ne semblent pas beaucoup déplacer leurs chloroplastes. En revanche, le mouvement est très important pour les plantes d’ombrage10,22,23.

Ce document sur les méthodes, axé sur la plante modèle A. thaliana, décrit comment utiliser un dispositif de transmission qui est une version mise à jour d’un instrument précédemment ^développé9. Bien que cet instrument ne soit pas disponible dans le commerce, les personnes ayant une compréhension de base de l’électronique ou l’aide de collègues et d’étudiants en ingénierie ou en physique seront en mesure de construire l’instrument en utilisant des pièces abordables et en suivant les instructions détaillées (voir Fichier supplémentaire). La plate-forme open source utilisée pour construire l’instrument dispose d’un support Web étendu et d’un forum communautaire qui offre de l’aide en cas de ^problème24.

Le protocole se concentre sur la façon d’utiliser l’instrument pour déterminer les changements dans la transmission des feuilles dans une série exploratoire standard qui expose une feuille à un large éventail de conditions de lumière et capture les réactions d’obscurité, d’accumulation et d’évitement d’A. thaliana. Ces pistes peuvent être modifiées en fonction de l’objectif de l’expérience et peuvent être utilisées avec la plupart des espèces végétales. L’article fournit des exemples de données de transmission de A. thaliana wildtype et de plusieurs mutants et montre comment analyser plus en détail les données.